En el presente estudio se evaluó el efecto de extractos fenólicos y de carotenoides procedentes de frutos de chiltepín sobre el crecimiento micelial y la germinación de conidios de Alternaria alternata y Fusarium oxysporum, 2 importantes hongos causantes de podredumbres en frutas y hortalizas. Los extractos fenólicos presentaron una inhibición en el crecimiento micelial de A.alternata del 38,46%, y redujeron significativamente la germinación de conidios al quinto día después del tratamiento al 92% en relación al control. No se observaron cambios significativos en el crecimiento micelial de F.oxysporum, pero sí se redujo significativamente al 85% en relación al control, el número de conidios germinados a los 5 días de tratamiento. Los extractos de carotenoides mostraron una inhibición del 38,5% en el crecimiento micelial y del 85,3% en la germinación de conidios de A.alternata, 5días después del tratamiento. Frente a F.oxysporum, dichos extractos presentaron menor inhibición del crecimiento micelial (20,3%), mientras que hubo una mayor inhibición en la germinación de conidios (96%). Los extractos fenólicos y de carotenoides de chiltepín pueden ser una alternativa promisoria de importancia agrícola como fungicidas naturales.
The effect of phenolic and carotenoid extracts from chiltepin fruits on mycelial growth and the inhibition of conidial germination of Alternaria alternata and Fusarium oxysporum were investigated in the present work. Phenolic extracts inhibited mycelial growth of A.alternata by 38.46%, and significantly reduced conidial germination on the fifth day after treatment to 92% in relation to control. No significant changes were observed in the inhibition of mycelial growth in Fusarium oxysporum; however, the number of germinated conidia was reduced, showing 85% inhibition five days after treatment in relation to control. Moreover, carotenoid extracts showed 38.5% inhibition of mycelial growth and 85.3% inhibition of conidial germination of A.alternata, five days after treatment. Carotenoid extracts showed less inhibition of mycelial growth (20.3%) in F.oxysporum, with respect to A.alternata; while there was greater inhibition of conidial germination (96%) on the fifth day after treatment. Phenolic and carotenoid extracts from chiltepin may be a promising alternative as a natural fungicide against fungi of agricultural importance.
Durante el almacenamiento y transporte de frutas y hortalizas, las infecciones causadas por hongos son consideradas las principales causas de podredumbres, lo cual ocasiona pérdidas económicas significativas durante su comercialización12. La principal forma de control de los hongos causantes de podredumbres en frutas y hortalizas es mediante la aplicación de fungicidas químicos2,24. Sin embargo, la presencia de hongos patógenos resistentes a la acción de los fungicidas derivados de síntesis química y la necesidad de contar con alimentos inocuos22,24 ha motivado la búsqueda de medidas alternativas al uso de agroquímicos que ayuden a reducir la presencia de hongos causantes de enfermedades en etapa productiva, sin afectar la salud del consumidor7.
Entre las alternativas para reducir la presencia de hongos en la etapa de poscosecha se contempla el uso de extractos de plantas. Estos extractos pueden ser una opción viable para sustituir las medidas actuales de control de hongos, basada en las propiedades antifúngicas de tales extractaos, en su baja o nula toxicidad y en la poca persistencia en el ambiente que estos presentan comparados con los compuestos químicos8,15.
Los metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana que pueden estar presentes en los extractos vegetales son terpenoides, compuestos fenólicos, fenilpropanoides, estilbenos, alcaloides y saponinas11. Estos metabolitos secundarios tienen la ventaja de ser rápidamente degradados en el suelo, generalmente no presentan un efecto tóxico en mamíferos y pueden ser empleados en los sistemas de agricultura orgánica y sustentable16. Entre los metabolitos secundarios, los compuestos fenólicos (como fenoles y flavonoides) se caracterizan por tener actividad antimicrobiana19. El efecto de estos compuestos se ha observado principalmente en hongos causantes de problemas de salud en humanos, como Candidaspp.
Se considera que el mecanismo involucrado en la actividad antimicrobiana frente a este tipo de patógenos puede estar relacionado con la inhibición de la germinación de los conidios del hongo9,14. Otro posible mecanismo puede ser la inactivación de la síntesis de aminoácidos esenciales causada por la interferencia en las reacciones del fosfoenolpiruvato, la eritrosa-4-fosfato y el ácido shiquímico, lo cual favorece la producción de triptófano y disminuye la producción de fenilalanina o tirosina6.
Pagnussatt et al.17 encontraron que compuestos fenólicos presentes en extractos obtenidos de microalgas redujeron el desarrollo de Fusarium graminearum mediante la inhibición de la síntesis de aminoácidos. Por otra parte, los carotenoides como la capsantina y la capsorubina, que son componentes claves asociados a la coloración roja del género Capsicum, pueden presentar efectos antibacteriales y antifúngicos4,10. En este sentido, Wilson et al.28 observaron que extractos de carotenoides obtenidos de Capsicum annuum, C.chinense y C.frutescens inhibieron hasta en un 99% la germinación de conidios de Botrytis cinerea. No obstante, aun cuando existe información sobre el efecto antifúngico de los extractos fenólicos y de carotenoides de diferentes especies de chile, los estudios sobre las propiedades antifúngicas del chiltepín (Capsicum annum L. var. glabriusculum), que es cosechado y consumido principalmente en la parte noroeste de México, son escasos. En el presente estudio se planteó el objetivo de evaluar el efecto in vitro de fenoles totales y carotenoides presentes en extractos de frutos de chiltepín sobre Alternaria alternata y Fusarium oxysporum, que son hongos de importancia agrícola en México.
Materiales y métodosPreparación de los extractos de chiltepínLas muestras consistieron en frutos de chiltepín (C.annuumL. var.glabriusculum) en estado rojo maduro, obtenidos al azar de mercados regionales de Mexicali, B.C., México, de febrero a marzo del 2012. Los frutos se lavaron con agua destilada estéril, seguido de la eliminación de semillas. Una vez realizado esto, se obtuvieron muestras compuestas de 10g de peso fresco, que se colocaron por triplicado en recipientes de aluminio para efectuar el secado a 65°C por 24h en una estufa convencional (GRIEVE Modelo LO- 201C. Round Lake, Illinois, EE.UU.). Transcurrido el tiempo de secado, las muestras de chile se molieron y se pasaron por una malla o tamiz de 100micrómetros.
Extracción de carotenoides de los frutos secos de chiltepínPara la obtención de los carotenoides de chiltepín, el procedimiento consistió en homogenizar 1g de la muestra con 80ml de acetona:hexano (1:1) durante 24h a 25°C en oscuridad, para evitar la degradación de los carotenoides. Posteriormente, la muestra fue centrifugada a 3.500rpm 10min, a 4°C. El sobrenadante obtenido (30ml) fue colocado en un evaporador rotatorio al vacío a 60°C, para eliminar el solvente. El producto obtenido fue colocado en campana de extracción durante toda la noche para completar la evaporación del solvente. Finalmente, las muestras obtenidas fueron almacenadas a −20°C hasta su uso.
Extracción de compuestos fenólicos de los frutos secos de chiltepínEl procedimiento consistió en homogenizar 100mg de la muestra de chiltepín con 5ml de metanol al 80% durante 45min usando un baño ultrasónico. Posteriormente, la muestra fue centrifugada a 4.500rpm 5min, a 4°C, y el sobrenadante fue filtrado usando papel de filtro de 90mm (Fisherbrand QL125).
El precipitado obtenido fue colocado en un evaporador rotatorio a 70°C para eliminar el resto de metanol. Finalmente, las muestras obtenidas fueron almacenadas a −20°C hasta su uso.
Origen y conservación de los hongos fitopatógenosCepas de A.alternata y F.oxysporum aisladas previamente de tejidos vegetales infectados se hicieron crecer en agar papa dextrosa (APD) a 27°C. Los patógenos fueron identificados macro y microscópicamente, de acuerdo a las claves reportadas por Simmons23. Para mantener viables a las cepas, se realizaron subcultivos de los fitopatógenos en APD, de acuerdo a lo propuesto por Tsror et al.26.
Actividad antifúngica de los extractos fenólicos y carotenoides de chiltepínLos bioensayos para determinar la actividad antifúngica de los compuestos extraídos de chiltepín sobre los hongos fitopatógenos mencionados se realizaron en medio de cultivo APD. Para tal fin, secciones de 0,5cm de diámetro de cultivos de A.alternata y F.oxysporum en crecimiento activo (10días de incubación) se sembraron en el centro de cajas de Petri con APD. A continuación se realizaron 4 perforaciones de 5mm de diámetro alrededor del hongo, a una distancia de aquel de 2cm. En cada perforación se colocaron 50μl de los extractos de fenoles y carotenoides a una concentración de 100mg/ml, considerando los trabajos de Riaz et al.20 y Kappel et al.14. Como testigo se utilizaron cajas de Petri con el hongo patógeno, donde en las 4 perforaciones se colocaron 50μl del solvente usado para la extracción de fenoles (metanol 80%) o de carotenoides (acetona:hexano).
A los 3 y 5días se midió el crecimiento micelial de cada uno de los hongos fitopatógenos evaluados y se calculó el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial mediante la siguiente fórmula:
donde R1 es valor promedio del radio de la colonia de referencia y R2 es el valor promedio del radio de la colonia inhibida por los extractos, como se describe en Pandey et al.18.Inhibición de la germinación de conidios de A.alternata y F.oxysporum
Para la determinación del efecto de los extractos fenólicos y de carotenoides de chiltepín sobre la germinación de conidios de A.alternata y F.oxysporum, se procedió a la obtención de conidios de ambos hongos fitopatógenos. Se realizó un raspado ligero de una cepa fúngica con una espátula Drigalsky, adicionando previamente 10ml de agua destilada estéril al medio APD. La suspensión obtenida se filtró con gasas estériles para eliminar micelio y fragmentos del medio de cultivo. Posteriormente, la suspensión de conidios de cada hongo se ajustó a una concentración de 1×108 conidios/ml usando una cámara de Neubauer. Dicha suspensión de conidios se mezcló con los extractos fenólicos y de carotenoides de chiltepín a una relación 1:1 (v/v). Una vez realizada la mezcla, se realizaron 5 puntos de siembra colocando 10μl en una caja Petri con APD, cubriendo con un cubreobjetos cada punto. A los 3 y 5días después de la siembra se registró el porcentaje de germinación de conidios con ayuda de un microscopio compuesto, con el objetivo de 100×. La germinación de conidios se definió como positiva cuando un tubo germinativo se extendió más de la mitad de la longitud de la célula.
El porcentaje de germinación del hongo se determinó contando al azar 100 conidios de cada punto de siembra y determinando la proporción de conidios germinados con respecto al total observado.
Análisis estadísticoSe utilizó un diseño completamente aleatorizado con 3 repeticiones y se realizó el análisis de varianza (ANOVA) con un nivel de significación de a=0,05. Además, se realizó una comparación de medias con la prueba de Tukey utilizando el paquete estadístico SAS (2000).
Resultados y discusiónLos extractos fenólicos de chiltepín inhibieron el crecimiento micelial de A.alternata en 41,28% y 38,46% al tercer y quinto día de evaluación, respectivamente (fig. 1). Con respecto al efecto de estos extractos sobre el número de conidios germinados, los resultados indicaron una disminución significativa al tercer y quinto día de evaluación (fig. 2). No obstante, fue al quinto día después del tratamiento donde se observó un mayor efecto inhibitorio (5,7×106 conidios germinados/ml), lo que representa una reducción del 92% en relación al control que presento un valor de 7,1×107 conidios germinados/ml). Estos resultados sugieren que los compuestos fenólicos tal vez interactúan con la pared celular del hongo inhibiendo algunas enzimas fúngicas, con lo que se afectaría la germinación de conidios y el crecimiento del micelio27.
En el caso de F.oxysporum, los extractos fenólicos no mostraron un efecto inhibitorio sobre el crecimiento micelial durante el período de evaluación (fig. 1). En cambio, se observó una disminución significativa con respecto al control en la germinación de conidios al tercer (0,95×107 conidios germinados/ml) y quinto día (1,0×107 conidios germinados/ml) después de la exposición (fig. 2); esta inhibición fue del 85%. Carrillo-Parra et al.5 informaron similares resultados; estos autores observaron que el incremento de las concentraciones de compuestos fenólicos y flavonoides puede inhibir de manera diferencial a Coniophora puteana y Trametes versicolor. Asimismo, Pagnussatt et al.17 comunicaron una disminución en el desarrollo de Fusarium graminearum al ser expuesto a extractos fenólicos obtenidos de microalgas. Recientemente, Ahn et al.1 encontraron que el ácido gálico y el metil galato aislados de Galla rhois inhibe la ruta de señalamiento relacionada con el ciclo de la adenil ciclasa, que participa en la formación del apresorio de Magnaporthe grisea.
La actividad antifúngica observada en los extractos fenólicos de chiltepín podrían deberse a que estos compuestos podrían formar complejos con proteínas solubles y extracelulares, generando una disrupción de la pared celular de los hongos13. Otra posibilidad es la inhibición de rutas enzimáticas vitales, como el sistema enzimático P450 oxidasa-dependiente, mediante el bloqueo de las enzimas hidrolasas esteroides de esta ruta por los flavonoides presentes en chiltepín25.
Por otra parte, los extractos de carotenoides procedentes de chiltepín generaron en A. alternata un efecto inhibitorio al tercer y quinto día de exposición de similar magnitud que el de los compuestos fenólicos (39,5% y 38,5%, respectivamente) (fig. 3). En cambio, el efecto inhibitorio fue menor en F.oxysporum: 8,75% y 20,3% al tercer y quinto día, respectivamente (fig. 3).
En cuanto al efecto de los extractos de carotenoides de chiltepín sobre la germinación de conidios, se observó que estos redujeron significativamente el número de conidios germinados de A.alternata, en un 85,3% a los 5 días (7,20×106 conidios/ml), comparado con lo registrado al tercer día (1,13×107 conidios/ml) después de la exposición. En F.oxysporum, el número de conidios germinados disminuyó en un 96% al pasar de 1,0×107 conidios/ml en el día tres a 1,5×106 conidios/ml observados en el día cinco (fig. 4). Estos resultados concuerdan con los hallazgos de Wilson et al.28, quienes mencionan que extractos de carotenoides obtenidos de diferentes especies de Capsicum inhibieron hasta en un 99% la germinación de conidios de B.cinerea. En este sentido, Santos et al.21 demostraron una disminución del crecimiento y la producción de aflatoxinas de A.flavus al usar una mezcla de carotenoides a base de capsantina y capsorubina, denominada Capsantal FS-30. Por otra parte, se debe considerar que propiedades químicas de los solventes tales como la polaridad pueden impactar diferencialmente en la eficiencia de los compuestos bioactivos. En este sentido, Bae et al.3 comunicaron que el uso de diferentes solventes (hexano, etil acetato, acetona, metanol y metanol-agua) puede afectar la capacidad antioxidante de los compuestos bioactivos presentes en el chile. Esto indica que se requieren nuevos estudios que permitan evaluar el efecto antifúngico de los compuestos fenólicos y carotenoides presentes en chiltepín usando diferentes mezclas de solventes.
La evaluación del efecto antifúngico de los extractos de chiltepín en otras especies de hongos de importancia agrícola también debe ser considerada, así como la posible realización de pruebas en condiciones de campo.
ConclusionesLos extractos fenólicos y carotenoides de chiltepín mostraron un efecto diferencial sobre el crecimiento y la germinación de conidios de A.alternata y F.oxysporum, dos hongos de importancia agrícola. Dada la presencia de estos metabolitos secundarios en el chiltepín, este fruto adquiere el potencial de ser usado en la obtención de compuestos bioactivos, con probable aplicación en el área del control de enfermedades poscosecha. Serían necesarios estudios enfocados a evaluar el efecto de los distintos solventes en el proceso de extracción de los compuestos bioactivos, para identificar el solvente o la mezcla de estos que permita obtener los compuestos con mayor actividad biológica.
Responsabilidades éticasProtección de personas y animalesLos autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.
Confidencialidad de los datosLos autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.
Derecho a la privacidad y consentimiento informadoLos autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.Referencias no citadas
