Los niveles de paracetamol se miden habitualmente en los laboratorios de urgencias ante la evidencia o sospecha de una intoxicación para predecir la posible hepatotoxicidad aguda por este fármaco. Sin embargo varios estudios han reportado un falso incremento en la concentración de paracetamol medida por métodos enzimáticos en plasmas ictéricos, circunstancia que ocurre frecuentemente en casos de fracaso hepático.
Material y métodosPara evaluar la influencia de la bilirrubina en la medición de paracetamol en el analizador Dimension® EXL™ (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.®) se preparó una solución primaria de interferente a una concentración de 800mg/dl (13.680μmol/l) que se añadió a una solución de control comercial con altos niveles de paracetamol hasta obtener una mezcla con una concentración de bilirrubina de 40mg/dl (684μmol/l) realizando la medición de paracetamol en esta mezcla y en una de referencia. Comprobada la existencia de interferencia se procedió a cuantificarla diluyendo la solución primaria hasta obtener mezclas con 20; 10; 5; 2,5; 1,25 y 0,625mg/dl de bilirrubina (342; 171; 85,5; 42,75; 21,37 y 19,69μmol/l). Se obtuvo el interferograma representando la desviación de la medida frente a la mezcla de referencia frente a las distintas concentraciones de interferente.
ResultadosLas distribuciones fueron gaussianas, por lo que se pudo aplicar la t de Student para el cálculo de las significaciones estadísticas. Se demostró la existencia de una interferencia significativa negativa a partir de 5mg/dl (85,5μmol/l) de bilirrubina, lo que muestra que las mediciones de paracetamol deben interpretarse con cautela en casos de hiperbilirrubinemia.
Blood levels of acetaminophen (paracetamol) are measured routinely in large acetaminophen overdoses or when poisoning is suspected, in order to predict the likelihood of hepatotoxicity. However some cases of spurious acetaminophen levels have been reported in jaundiced patients.
Material and methodsThe interference of bilirubin in acetaminophen measurements was studied on the Dimension® EXL™ by preparing a primary mixture of bilirubin at 800 mg/dL, which was spiked to a quality control solution with high acetaminophen concentration in order to get a bilirrubin concentration of 40 mg/dl on the mixture. Acetaminophen concentration was measured in the mixture with bilirubin and in reference solution without bilirubin. Interference was assessed and quantified by diluting the bilirubin solution to achieve final concentrations of 20, 10, 5, 2.5, 1.25 and 0.625mg/dl (342, 171, 85.5, 42.75, 21.37 and 19.69μmol/l). A graph of the interference was obtained showing the bias of acetaminophen concentrations with reference solution vs. increasing bilirubin concentrations.
ResultsAcetaminophen concentrations in both solutions followed Gaussian distributions. The t test showed significant negative interference at bilirubin concentrations higher to 5mg/dl (85.5μmol/l), which means that blood acetaminophen concentrations must be interpreted with caution in cases of hyperbilirubinemia.
La toxicidad por fármacos es la tercera causa de fallo hepático agudo, entre los cuales el 25% acaban en una necrosis hepática fulminante1. Debido a su amplio consumo al tratarse de un medicamento que se dispensa sin receta médica, el paracetamol (N-acetil-p-aminofenol) ocupa un lugar destacado entre los tóxicos más frecuentemente involucrados en fallo hepático agudo en los servicios de Urgencias. Más del 90% del paracetamol ingerido es conjugado a través de reacciones de fase II en glucurónidos y sulfatos, metabolitos desprovistos de toxicidad que son excretados por la orina2. Sin embargo, menos del 5% se metaboliza a través de la isoenzima del citocromo P-450, 2E1 (CYP2E1) generando un producto altamente reactivo y tóxico, la n-acetil-p-quinoneimina (NAPQI), que en condiciones fisiológicas es detoxificada por el glutatión hepático y eliminada como ácido mercaptúrico2. En casos de sobredosis por paracetamol o en cualquier otra situación en la que las reservas hepáticas de glutatión caigan por debajo del 30% la NAPQI se une a las proteínas hepáticas, causando necrosis centrolobulillar3,4. En casos de sobredosis por paracetamol se debe establecer antes de las 12h el tratamiento con N-acetilcisteína (NAC), compuesto donador de sulfhidrilos que minimiza el daño hepático producido por las altas dosis de paracetamol. La determinación de los niveles plasmáticos de paracetamol por el laboratorio de urgencias juega un papel destacado a la hora de predecir la probabilidad de necrosis hepática, así como de establecer la necesidad del tratamiento con el antídoto4,5.
Dejando a un lado los métodos cromatográficos que se consideran el gold standard, el paracetamol puede ser medido por 2 grupos de métodos en los laboratorios de urgencias. Por un lado, los métodos enzimáticos cromogénicos, ampliamente extendidos que por lo general utilizan una amidasa para producir p-aminofenol que reacciona con un reactivo cromogénico para producir un compuesto coloreado. Aunque menos extendidos y más caros también están disponibles en equipos automatizados los inmunoensayos homogéneos. Los métodos enzimáticos son más sensibles a interferencias tanto endógenas como exógenas3,4 que los inmunoensayos. Entre los posibles interferentes en estos métodos cromogénicos la bilirrubina es el principal candidato, debido a su intensa absorbancia en un amplio rango de longitudes de onda del espectro ultravioleta y visible. De hecho han sido reportados varios casos de niveles falsamente elevados de paracetamol cuantificado con métodos enzimáticos en pacientes con fallo hepático e hiperbilirrubinemia que negaban la ingesta del analgésico3,4,6.
En el presente estudio nos proponemos demostrar la existencia de una interferencia de la bilirrubina en la medición del paracetamol con nuestro método adaptado a la plataforma Dimension® EXL™ (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.®) que consiste en la producción de indofenol que absorbe fuertemente la luz a 600nm, a partir de la hidrólisis enzimática del paracetamol y reacción con un compuesto cromogénico aromático. Una vez evidenciada la existencia de interferencia procederemos a cuantificarla expresándola gráficamente en forma de interferograma.
Material y métodosEn nuestro laboratorio utilizamos para medir los niveles de paracetamol un método que se basa en el uso de una amidasa específica de las amidas aromáticas. La enzima rompe la molécula de paracetamol, produciendo p-aminofenol, el cual reacciona específicamente con o-cresol en una solución amoniacal de cobre dando lugar a indofenol, que absorbe la luz a 600nm. La cantidad de aminofenol producida es proporcional a la concentración de paracetamol y se mide usando una técnica bicromática a punto final en el analizador ® EXL™ (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.®).
Para evaluar la influencia de la bilirrubina en la cuantificación de paracetamol utilizamos un protocolo basado en las recomendaciones de la SEQC para el estudio de interferencias endógenas con algunas modificaciones7. Se preparó una solución primaria de interferente disolviendo 24mg de bilirrubina no esterificada (Merck®) pesada en la oscuridad en 3ml de NaOH 0,1N. Se añadieron 100μl de esta solución primaria de interferente a 1,8ml de una solución de control de calidad (TDM PLUS®, Siemens Healthcare Diagnostics Inc.®) con altos niveles de paracetamol, añadiendo a continuación 100μl de HCl 0,1N para neutralizar el medio, con lo que se obtiene una mezcla problema con una concentración de bilirrubina de 40mg/dl. La mezcla de referencia se obtuvo añadiendo a 1,8ml de la misma solución de control de calidad 100μl de NaOH 0,1N y 100μl de HCl 0,1N de modo que la concentración final de paracetamol es la misma en ambos especímenes. Se hicieron 15 mediciones de paracetamol en las 2 mezclas. La normalidad de la distribución de las 2 series de resultados se evaluó mediante el test de D¿Agostino-Pearson usando el paquete estadístico SPSS® v.15.0. Dada la gaussianidad de las distribuciones se aplicó la prueba t de Student para evaluar la significación de la interferencia. Comprobada la existencia de interferencia se procedió a cuantificarla diluyendo la solución primaria hasta obtener mezclas con 20; 10; 5; 2,5; 1,25 y 0,625mg/dl de bilirrubina (342; 171; 85,5; 42,75; 21,37; 19,69μmol/l). En cada una de estas soluciones se midió el paracetamol por quintuplicado. Se representó gráficamente la media de los resultados de cada solución frente a las concentraciones de bilirrubina, obteniéndose la ecuación de regresión que describe la interferencia. Además se obtuvo el interferograma representando la desviación de la medida en porcentaje respecto a la mezcla de referencia frente a las distintas concentraciones de interferente. Se consideró que existía interferencia significativa si había significación estadística (p<0,05).
ResultadosSe obtuvieron las medias y las desviaciones estándar de cada distribución para la mezcla problema y la de referencia. Las distribuciones de resultados en la serie de la mezcla problema y la mezcla de referencia fueron gaussianas (p=0,12 para la mezcla problema, y p=0,63 para la de referencia), por lo que se pudo aplicar la t de Student para el cálculo de las significaciones estadísticas. En la tabla 1 se resume el resultado del test de la t de Student para la comparación de la mezcla con interferente y la muestra de referencia.
Puesto que el intervalo de confianza de la media de las diferencias no contiene el cero y p<0,0017, la interferencia es estadísticamente significativa, procediéndose a su cuantificación. Al cuantificar paracetamol en cada solución con niveles crecientes de bilirrubina se obtuvo una recta regresión descrita por la ecuación y=117,0261-1,3880x, siendo x la concentración de interferente e y la concentración de paracetamol con un coeficiente de determinación R2=0,996. El signo de la pendiente de la recta de regresión nos indica que se trata de una interferencia negativa. La cuantificación de la interferencia se muestra gráficamente en forma de interferograma (Glick et al.8) en la figura 1.
Utilizando el criterio de la significación estadística (p<0,05) se observa que existe interferencia significativa para concentraciones de bilirrubina iguales o superiores a 5mg/dl (85,5μmol/l) (tabla 1).
Cuantificación del paracetamol en la solución primaria de interferente (40mg/dl de bilirrubina) frente a la solución de referencia sin interferente
| Solución de interferente (40mg/dl bilirrubina) | Solución referencia | |
| Media | 61,546 | 117,693 |
| Desviación estándar | 1,164 | 0,655 |
| Diferencia media | 56,147 | |
| IC 95% | 55,219-57,074 | |
| t | 129,89 | |
| p | <0,001 |
IC 95%: intervalo de confianza del 95%; p: probabilidad de cola; t: estadístico de la prueba de la t de Student.
De nuestro estudio se deduce que la bilirrubina produce interferencia negativa en el método de medida del paracetamol con indofenol acoplado a Dimension® EXL™. La interferencia es significativa a partir de una concentración de 5mg/dl de bilirrubina (85,5μmol/l).
El paracetamol es el principal tóxico implicado como causa de fallo hepático en las urgencias de nuestros hospitales1,2, siendo la determinación de sus niveles clave para establecer con prontitud la terapia con N-acetilcisteína5. La bilirrubina es uno de los compuestos endógenos más proclives a producir interferencias, dada su amplia e intensa absorción en el espectro ultravioleta y visible3. Diversos estudios han demostrado la producción de resultados falsos positivos para el paracetamol en plasmas con hiperbilirrubinemia en pacientes que negaban el consumo del fármaco y en los que se mostró la ausencia de paracetamol en la muestra mediante metodologías más específicas. Bertholf et al.3 encuentran niveles detectables de paracetamol entre 5 y 18μg/ml (33 y 119,16μmol/l) en 12 especímenes de pacientes que negaban la ingesta del analgésico, con concentraciones de bilirrubina comprendidas entre 15,9 y 33,8mg/dl (271,9 y 578μmol/l), usando un método enzimático acoplado a la producción de indofenol con o-cresol. Al diluir estos especímenes de forma seriada con salino (1:2, 1:3) mostraron falta de linealidad en la concentración de paracetamol. Fong et al.4 reportan un caso de una paciente de 31 años con fallo hepático severo (bilirrubinemia 71mg/dl o 1.210μmol/) en la que se solicita determinación de paracetamol, obteniéndose unos niveles de 18μg/ml (121μmol/l) con un método enzimático colorimétrico. La paciente negaba el consumo de paracetamol, evidenciándose además que los niveles del fármaco se mantenían constantes a las 24 y 48h del ingreso, lo que era incoherente con el comportamiento farmacocinético. Al sospecharse una interferencia analítica se sometió al plasma una ultrafiltración para eliminar la influencia de la bilirrubina y se determinó paracetamol en el ultrafiltrado hallándose niveles indetectables (<4μg/ml). Al medir paracetamol mediante HPLC en el plasma original se obtienen también valores inferiores al límite de detección (<1μg/ml). Por su parte Polson et al.6 encuentran 2 casos de pacientes con fallo hepático agudo y concentraciones de bilirrubina de 34,8mg/dl y 28mg/dl (595 y 479μmol/l) hallándose niveles de paracetamol de 14,2 y 30μg/ml (94 y 199μmol/l) respectivamente, medidos con un método colorimétrico y en los que al diluir la muestra (1:1) no se hallaron niveles detectables del fármaco. Estos mismos autores reúnen 36 sueros hiperbilirrubinémicos testados como negativos para paracetamol mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC/MS), en los que se realiza el ensayo de paracetamol por varios métodos automatizados, incluyendo métodos enzimático-colorimétricos como el nuestro e inmunoensayos (EMIT, FPIA). Se evidenció en este estudio que los inmunoensayos homogéneos no eran afectados por la interferencia, mientras que los métodos cromogénicos producían resultados espurios para el paracetamol, principalmente a partir de 10mg/dl de bilirrubina (171μmol/l).
Nuestro método es un método enzimático-colorimétrico que produce como producto final indofenol, el cual absorbe fuertemente la radiación a 600nm. Al revisar el procedimiento normalizado de trabajo del fabricante (Siemens Healthcare Diagnostics Inc.®) encontramos ausencia de interferencia significativa (<10% de desviación, según el fabricante) con 5mg/dl (85,5μmol/l) de bilirrubina y una interferencia negativa (−21%) con 20mg/dl (342μmol/l) de bilirrubina. Cuando realizamos nuestro estudio de interferencia encontramos una significación estadística para concentraciones de bilirrubina de 5mg/dl (85,5μmol/l) o superiores. Nosotros consideramos que nuestro criterio es el que más se ajusta al citado documento de la Sociedad Española de Bioquímica Clínica y Patología Molecular7 y es el más riguroso desde el punto de vista estadístico que el ampliamente aceptado del 10% de desviación que aparecen recogidos en la mayoría de las instrucciones de los fabricantes de reactivos. No hemos encontrado referencias en la literatura que estudien la interferencia de la bilirrubina en la medida del paracetamol en plasma o suero humanos.
En resumen, concluimos que el método del indofenol para la determinación del paracetamol en Dimension® EXL™ produce errores en presencia de concentraciones de bilirrubina de 5mg/dl (85,5μmol/l) o superiores, siendo preferible el uso de métodos inmunoanalíticos para evitar esta interferencia. Por fortuna ante un caso de fallo hepático agudo por paracetamol las concentraciones plasmáticas de bilirrubina se elevan casi 24h tras la ingesta del fármaco, mientras que los primeros síntomas de la intoxicación se presentan a las pocas horas, que es cuando el paciente suele acudir a urgencias y cuando es útil medir los niveles de paracetamol4. En todo caso las concentraciones plasmáticas de paracetamol deben interpretarse con cautela en presencia de hiperbilirrubinemia cuando se usan métodos enzimáticos colorimétricos como el de nuestro laboratorio. Nosotros recomendamos en lo posible la implantación de métodos de inmunoanálisis homogéneo para la medida de la concentración de paracetamol en suero o plasma humanos, que además presentan la misma facilidad de uso y rapidez que los métodos colorimétricos, si bien tienen un coste económico ligeramente superior.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún tipo de conflicto de interés con las firmas comerciales implicadas en el estudio.
