REVISTA DE ORTOPEDIA Y TRAUMATOLOGÍA
Volumen 42, pp 396-404
© 1996 EDITORIAL GARSI
Aloinmunotrasplante de nervio periférico inmunosuprimido con FK-506*
J. A. DE PEDRO MORO, A. PÉREZ CABALLER, R. LÓPEZ CASERO, A. LÓPEZ BRAVO y M. DÍEZ DE ANGULO
Hospital Clínico y Clínica Moncloa. Madrid.
INVESTIGACIÓN
RESUMEN: Son diferentes las posibilidades de reconstruir la pérdida de una longitud considerable de nervio periférico, bien sea por resección tumoral o pérdida traumática. Puede utilizarse aloinjerto, con la problemática de la yatrogenia de la zona donante y la limitación de su extensión. Por otro lado se pueden utilizar aloinjertos de nervio periférico con el problema de los riesgos de rechazo. Los objetivos propuestos en el presente estudio son evaluar con fármaco inmunosupresor el FK-506 en un biomodelo de trasplante de nervio periférico utilizando ratas con barrera de histocompatibilidad alta BN y Wistar. Se han utilizado dos lotes de 30 ratas cada uno del mismo sexo y peso y mantenidas en las mismas condiciones ambientales. La evaluación de los resultados se siguió mediante análisis histológico, morfométrico y electrofisiológico. El grupo inmunosuprimido evidenció, una vez presente la generación nerviosa a las 8 semanas, un mejor análisis histológico, morfométrico y electrofisiológico.
PALABRAS CLAVE: Regeneración nerviosa. Inmunosupresión con FK-506. Trasplante de nervio periférico.
ALLOIMMUNOTRANSPLANTATION OF PERIPHERAL NERVE USING THE IMMUNOSUPPRESSANT FK-506
ABSTRACT: Different possibilities are available for reconstruction after the loss of a long section of peripheral nerve as a result of tumor resection or trauma. Autografts can be used, which produces yatrogenic problems in the donor zone and has a limited extension. On the other hand, peripheral nerve allografts have problems of rejection. This study was undertaken to evaluate the use of the immunosuppressant FM-506 in a biomodel of peripheral nerve transplantation in rats with a high histocompatibility barrier, BN and Wistar rats. We used two lots, with 30 rats each, which were of the same sex and weight and were kept in the same environmental conditions. Results were evaluated by histological, morphometric and electrophysiological analysis. The group treated with the immunosuppressant had better histological, morphometric, and electrophysiological nerve regeneration results 8 weeks
after surgery.
KEY WORDS: Nerve regeneration. FK-506 immunosuppression. Peripheral nerve transplantation.
La reparación del tejido nervioso lesionado ha sido motivo de investigación desde hace siglos. Tras superar la idea, hace más de 100 años, de que los nervios podían regenerar espontáneamente y que su manipulación podía impedir la funcionalidad del mismo, han sido numerosos los científicos que han profundizado en el estudio de la regeneración del nervio periférico.
En el pasado siglo, Waller20 describió la degeneración de axones y mielina producida en el segmento distal de una fibra lesionada (degeneración walleriana). En el mismo ámbito demostró el sobrecrecimiento de axones desde el extremo proximal del nervio afectado (regeneración walleriana).
Desde entonces han sido aplicados numerosos y diversos métodos de tratamiento tanto conservadores como quirúrgicos, no sólo a nivel experimental, sino también en la práctica clínica, obteniéndose con todos ellos un importante avance en el conocimiento de este tema.12
Así se sabe que en una fibra nerviosa lesionada sólo existirá regeneración de la misma si el soma celular permanece intacto. Posteriormente, del extremo proximal seccionado habrán de nacer nuevas ramas en longitud y diámetro en dirección al extremo distal para crear nuevas conexiones sinápticas, restableciéndose así la continuidad de la fibra y su funcionalidad.
En base a lo publicado por Mackinon y cols.12 puede lograrse la restauración de la fibra nerviosa lesionada, para lo cual debe procurarse un adecuado y cuidadoso manejo del tejido; entre los principios básicos en el manejo del nervio periférico destacan los siguientes:
a) Cualquier reparación nerviosa ha de hacerse siempre sin tensión, ya que lo contrario producirá un incremento del grado de fibrosis en la línea de sutura, lo que provocaría una disminución de su funcionalidad.
b) Es importante mantener una correcta alineación y enfrentamiento de los fascículos nerviosos con el fin de evitar la formación de neuromas en la zona de unión que afecten a la transmisión nerviosa.
c) En el caso de que la lesión sea extensa y no pueda hacerse una reparación sin tensión será necesario interponer un material que sustente o sirva de estructura para facilitar la regeneración de las fibras, guiándolas hasta el segmento distal.
Los estudios experimentales de Dellon4 han demostrado que tanto el neurotrofismo (capacidad de influir sobre la maduración de la fibra nerviosa) como el neurotropismo (capacidad de influir sobre la dirección de su crecimiento) desempeñan un papel importante en el campo de la reparación nerviosa, cuyo ideal sería optimizar al máximo los efectos de ambos.
Esta capacidad de «crecimiento dirigido» de la fibra nerviosa ha suscitado una repetida búsqueda de diversos materiales y tejidos que, interpuestos entre las fibras, sirvan de estructura para su elongación. En esta línea se pretende realizar este trabajo empleando como material de unión un aloinjerto nervioso que ya otros autores establecieron como estructura ideal para regenerar lesiones en este tejido.18
Dado que el mayor obstáculo para que la reparación se lleve a cabo es la respuesta inmune de rechazo que el propio organismo desencadena frente al huésped, antigénicamente distinto, hemos querido estudiar la influencia del fármaco inmunosupresor FK-506, de probada eficacia en trasplantes de riñón, hígado, pulmón y corazón.
La efectividad del fármaco ha sido valorada en base a los resultados obtenidos mediante estudio inmunohistoquímico, que permite la identificación del patrón celular implicado en la reacción de rechazo y su modificación al aplicar el fármaco inmunodepresor; estudio morfométrico de la densidad de fibras nerviosas regeneradas bajo la influencia del fármaco, y electroestimulación de la fibra nerviosa regenerada, verificando la recuperación de su funcionalidad.
Para establecer el tiempo de duración del experimento en orden a obtener regeneración nerviosa se ha decidido emplear dos tiempos de 5 y 11 semanas para valorar comparativamente el progresivo crecimiento de fibras, teniendo en cuenta, según estudios previos de diversos autores, que antes de este tiempo la regeneración es mínima.9,11,12
Históricamente, y siguiendo las pautas marcadas por Galeno durante siglos, los cirujanos que se encontraban ante un nervio periférico seccionado evitaban cualquier intento de reparación, e incluso convertían las secciones parciales en totales para evitar la aparición de «convulsiones».10
Hasta finales del siglo XIX no se comenzó a aceptar la reparación de un nervio periférico seccionado mediante la sutura de su tejido conjuntivo. El objetivo de esta etapa, que podríamos llamar «era mecánica», era conseguir el afrontamiento más exacto posible entre los extremos del nervio seccionado. Muchos cirujanos como Schiff (1851) llegaron incluso a pensar, de forma errónea, que si esta reparación se efectuaba de urgencia se produciría una cicatrización primaria, evitándose así el proceso de degeneración walleriana del segmento distal.20
En 1863, Philipeaux y Vulpian publicaron un artículo en el que describían la realización del primer aloinjerto nervioso en perros cuyo fracaso les llevó a continuar la línea del trasplante utilizando injertos autólogos.4
Durante el último siglo se produce un avance significativo en el desarrollo de la cirugía del nervio periférico basado en la aplicación de técnicas que ya habían sido perfiladas con anterioridad y que pudieron emplearse en el tratamiento de un importante número de traumatismos del nervio periférico producidos durante la segunda guerra mundial. Cirujanos ingleses como Seddon17 y Yahr,23 entre otros, desarrollaron las reparaciones tempranas del nervio periférico, defendiendo como más prometedora la técnica de reparación nerviosa de tipo epineural frente a la perineural.
Respecto a la cirugía del trasplante nervioso ya en nuestro siglo podemos citar a Barnes2 como uno de los pioneros de la terapia en humanos ya en 1946. Previamente, Guttman5en 1942 y Seddon17 en 1943 tras realizar experimentos en humanos y animales con homotrasplantes concluyeron que el límite para obtener la viabilidad de un injerto nervioso estaba en 30 mm de longitud. En relación a esto, Mackinon12 defendió el fenómeno de rechazo en injertos de mayor longitud como responsable del fallo de un aloinjerto nervioso, el cual mostraba una reacción inflamatoria difusa y una fibrosis secundaria que fueron atribuidas a una reacción inmune del tejido huésped. Con anterioridad Hubbel,7 en sus experimentos clásicos, había definido el autoinjerto como material ideal para el trasplante.
Fueron utilizadas diferentes técnicas en la práctica del trasplante nervioso con distinta aceptación entre los cirujanos de nuestro tiempo. Así, Seddon17 diseñó el uso de injertos tipo cable en el que varios segmentos de un nervio cutáneo unidos entre sí por diferentes métodos formaban un cable de la misma talla que el nervio a reparar, técnica que no llegó a ser muy popular, llevándose a cabo muy pocos casos en varios años.
Para plantear la hipótesis de trabajo hemos partido de las siguientes premisas:
a) En una fibra nerviosa lesionada sólo existirá regeneración de la misma si el soma celular permanece intacto. Posteriormente, del extremo proximal seccionado habrán de nacer nuevas ramas en longitud y diámetro en dirección al extremo seccionado distal para crear nuevas conexiones sinápticas, restableciendo así la continuidad de la fibra y su funcionalidad.
b) Los defectos nerviosos deberían poder ser sustituidos, de una forma ideal, por segmentos del mismo nervio y mismo emplazamiento que el segmento defectuoso para garantizar al máximo la recuperación de su funcionalidad. Siendo insuficiente la fuente de material nervioso autólogo en el ser humano, se establece el aloinjerto de nervio como la estructura ideal para reparar lesiones de este tejido.
c) La diferencia de resultados obtenidos entre el trasplante autólogo y alogénico de nervio periférico radica principalmente en el rechazo inmunológico del injerto, que se produce como consecuencia del reconocimiento de los antígenos de histocompatibilidad del mismo por el huésped.
Teniendo en cuenta todo lo anterior y como hipótesis de base nos planteamos la posibilidad de que un reciente fármaco de síntesis, denominado FK-506, con propiedades depresoras del sistema inmune, pudiera inhibir la reacción de rechazo responsable de la mayoría de los fracasos de trasplante nervioso alogénico.
En este ámbito, el FK-506 ha demostrado ser un potente inmunosupresor de síntesis, de probada eficacia en trasplantes de otros órganos como pulmón, corazón, hígado y riñón, que ha demostrado ser de 10 a 100 veces más potente in vitro que la CyA e in vivo ha resultqado ser 10 veces más potente que la misma droga para inhibir la reacción injerto-contra-huésped, habiéndose aplicado clínicamente en algunos trasplantes de órganos, y, aunque no exento de toxicidad y efectos secundarios adversos que se presenta siempre en relación a la dosis y vía de administración, este fármaco ha demostrado carecer casi por completo de toxicidad en animales de experimentación al administrarlo a dosis reducidas.
Por tanto, y en base a estas premisas, podemos concretar nuestra hipótesis planteando que siendo el FK-506 el mayor fármaco inmunosupresor conocido hasta el momento y siendo su potencia muy superior a la de otros fármacos actuales y su toxicidad considerablemente menor al haberse obtenido con esta droga resultados notorios en el trasplante de otros órganos, podemos suponer que el resultado puede ser igualmente positivo al aplicarlo como inhibidor de la reacción inmunológica de rechazo en el trasplante de nervio periférico, obteniendo con ello una adecuada regeneración histológica del mismo y una recuperación de su funcionalidad, lo que podrá ser de utilidad clínica en humanos para solventar lesiones nerviosas de extensión y complejidad importantes.
Material y Método
Para la realización del estudio se han empleado ratas machos de las cepas Wistar como receptoras y ratas BN (Brown Norway) como cepa donante. Ambas presentan diferentes marcadores de identidad para dar cabida a la posibilidad de rechazo postrasplante.
Todos los animales han sido suministrados por Iffa-Credo y se han mantenido en las condiciones habituales en el animalario del Servicio de Medicina y Cirugía Experimental.
Los animales, todos de peso aproximado entre 225-275 g para hacer homogéneos los grupos, fueron observados durante los días previos a la intervención y seleccionados solamente aquellos libres de enfermedades como diarrea, parasitación externa, conjuntivitis, caída de pelo o rinitis. Durante este período tuvieron una dieta ad libitum.
Para la realización de este trabajo se utilizó el fármaco inmunosupresor FK-506 facilitado por los laboratorios Fujisawa (Osaka, Japón).
El FK-506 pertenece al grupo antibiótico de los macrólidos. Su fórmula molecular es C44H69NO12-H2O y su peso molecular es 822,05. El fármaco es soluble en metanol, etanol, acetona, etilacetato, cloroformo y dietiléter; moderadamente soluble en hexano y petróleo-éter e insoluble en agua. Asimismo se mantiene estable en condiciones medioambientales normales, así como en un medio ácido muy diluido y admite ser almacenado bajo condiciones extremas tales como altas temperaturas, humedad ambiental elevada y
bajo exposición luminosa de lámparas fluorescentes.
La forma de presentación para su administración i.m. es en viales conteniendo el fármaco en forma de polvo seco de color blanco cuyas características de identidad son las siguientes: producto, FK-506 (20 mg/vial); lote número 700952K; fecha de análisis/envasado, 10 de Marzo de 1995; descripción, polvo blanco; pH, 6,30; disolventes, etanol (0,045%); agua, 0,84%, y excipientes, 54 mg/víal.
La preparación de la suspensión para la administración i.m. es la siguiente:
Teniendo en cuenta que cada vial contiene 20 mg de FK-506 y 54 mg de excipiente, cada 37 mg de la formulación contenida en el vial corresponden a 10 mg de FK-506 que habrá de disolverse en suero salino hasta obtener la concentración deseada. En nuestro trabajo se han utilizado dos viales de 20 mg de FK-506 que se han diluido en 100 cc de suero salino cada uno. La dosis utilizada ha sido de 0,23 mg/kg/día de tratamiento.
Una vez realizada la solución, ésta permanece como suspensión que ha de almacenarse en refrigerador o congelador y tiene una estabilidad de al menos 2 meses desde su obtención. Para su correcta administración vía i.m. la solución ha de agitarse enérgicamente antes de utilizarse y, debido a que la suspensión puede producir cierta irritación tisular local durante su administración, es recomendable aplicar el fármaco alternando el lugar de venopunción durante los días de tratamiento. La formulación utilizada en este estudio sólo admite ser utilizada en animales y nunca en humanos.
Para realizar el estudio inmunohistoquímico se han utilizado antisueros de rata que permiten la detección de las células más representativas implicadas en la reacción de rechazo postrasplante.
Los anticuerpos primarios antirrata empleados, cuya referencia antígeno específico que detecta y clon al que pertenece, se detallan en la Tabla 1.
| Tabla 1. Descripción de la referencia, antígenos específicos y clones de los anticuerpos primarios antirrata empleados en este estudio. | ||
| Referencia | Antígeno específico | Clon |
| MC 52 | Pan T | MRC OX 19 |
| MCA 55 G | CD4 y macrófagos | W3/25 |
| MCA 48 G | CD8 | MRC OX 8 |
| MCA 274 | Macrófagos | MRC OX 41 |
| MCA 94 | MHC clase I | F 16-4-4 |
| MCA 50 | MHC clase II | MRC OX 17 |
El anticuerpo secundario utilizado corresponde al PAP de referencia C 100 3K 250. Todos los productos utilizados han sido obtenidos de los laboratorios Serotec (Reino Unido) a través de su delegación en España (casa Atom en Madrid). Para la evaluación de la conducción electrofisiológica se ha utilizado el dispositivo TOF GUARDINMT de la casa Biometer International S/A.
Para una investigación cientificoclínica rigurosa y exigente es preciso recurrir a estimuladores complejos y sofisticados, con ondas cuadradas o rectangulares, con la posibilidad de variar la frecuencia de los estímulos desde 0,01 a 1.000 Hz, con posibilidad de regular el voltaje desde 15 mV hasta 350 V.
Tipo de electrodos
Se utilizaron agujas subcutáneas, teniendo cuidado de dejar las puntas de las agujas próximas, pero no dentro, del nervio; procurando también que las puntas de las agujas estén separadas la una de la otra por lo menos 1 cm. Tanto las agujas como los hilos eléctricos fueron fijados a la piel con adhesivos y orientados en el sentido del eje longitudinal del nervio.
Polaridad de los electrodos
El electrodo negativo se coloca sobre la parte distal del nervio y el positivo sobre la porción proximal.
Intensidad de los estímulos
Los estímulos son supramáximos. El estimulador es regulable, procediendo de la siguiente manera: se colocan los electrodos sobre la línea del nervio ciático, se escoge la frecuencia de 0,1 Hz (estimulación simple: un estímulo cada 10 seg); se conecta el estimulador manteniendo el nivel de intensidad en el valor más bajo y se observa si hay o no respuesta mecánica a nivel de la extremidad, y se aumenta gradualmente la intensidad de la estimulación, de división en división, hasta que se obtienen respuestas visibles en la extremidad; una vez obtenidas estas respuestas se coloca el indicador de intensidad de 0,5 a una unidad por encima de aquella que desencadenó las primeras respuestas visibles de la extremidad. Esta intensidad es la llamada «supramáxima» o «supralaminar».
Frecuencia de los estímulos
a) 0,1 Hz, estimulación simple o twitch. Interesa sobre todo cuando lo que se estudia es el «análisis de tiempos». La amplitud de las respuestas mecánicas a la frecuencia de 0,1 Hz es la amplitud de referencia para los test o para el estudio que utilizan otras frecuencias. Los tiempos pueden ser repetidos en valores absolutos o bien ser anotados en valores correlativos.
b) 2 Hz, tren de cuatro o train of four. La frecuencia de 2 Hz es una frecuencia antifisiológica que produce un agotamiento de la liberación de acetilcolina sin acelerar ni la captación de colina, ni la resíntesis de acetilcolina, ni la movilización de la acetilcolina de reserva. De aquí que una serie de cuatro estímulos con una frecuencia de 2 Hz acabe produciendo un agotamiento más o menos pronunciado de las tres últimas respuestas. Un punto de máxima importancia cuando se utiliza la monitorización con salvas de cuatro estímulos es el intervalo de tiempo que debe de existir entre las diferentes salvas que
deben ser, como mínimo, iguales o superiores a los 10 segundos (tiempo mínimo necesario para que se rehaga la carga de acetilcolina inmediatamente disponible). En otras palabras, la repetición de salvas de cuatro estímulos con intervalos de tiempo inferiores a los 10 segundos acabará por producir un agotamiento de acetilcolina que nos llevará a un falso diagnóstico. En términos prácticos la primera respuesta de un tren de cuatro estímulos tiene una amplitud perfectamente idéntica a la respuesta a una
estimulación simple (0,1 Hz). La amplitud de la primera respuesta de un tren de cuatro se correlaciona esencialmente por el número de receptores postsinápticos ocupados (bloqueados). Pero las tres últimas respuestas, particularmente la cuarta, presentan un agotamiento, una disminución de amplitud en relación a la primera respuesta.
c) 30-200 Hz o estimulación tetánica. Las frecuencias superiores a 30 Hz producen respuestas más amplias de las que se originan con la frecuencia de 0,1 Hz (por causar una mayor liberación de acetilcolina y, consecuentemente, por estimular un mayor número de receptores postsinápticos). La valoración de la tensión-desplazamiento producida por la estimulación tetánica debe ser hecha durante 5 segundos.
Resultados
A nivel de microscopia de luz no se observan grandes diferencias entre las muestras pertenecientes a los animales controles (los operados y no sometidos a ningún tratamiento posterior) y aquellos operados y sometidos posteriormente al tratamiento con un inmunosupresor. Los resultados demuestran que el nervio ciático en los animales controles se encuentra algo desgajado y separado de su envuelta conjuntiva, pero en general su estructura no presenta alteraciones en particular, aunque puede señalarse una cierta desorganización en las fibras. Pueden observarse ciertos acúmulos linfoides en las zonas en las que se seccionan los puntos de sutura.
En los animales tratados con el inmunosupresor se observa una buena estructura histológica del nervio ciático. A mayor aumento pueden distinguirse algunas células de naturaleza macrofágica; sin embargo, la mayor parte de las células de naturaleza linfoide se observan en la periferia del nervio, por fuera de su envoltorio y alrededor de las zonas correspondientes a los puntos de sutura.
La observación del inmunomarcaje contra timocitos y células T reveló una reacción positiva en algunas células linfoides en el interior del nervio ciático y asociadas a la periferia del mismo y a los puntos de sutura en la zona medial del nervio, tanto de los animales de 5 como de 11 semanas. En los nervios procedentes de los animales sometidos a tratamiento durante 5 a 11 semanas con FK la reacción inmunohistoquímica contra timocitos y células T fue más débil y se localizó principalmente en la envuelta conjuntiva que se halla rodeando al nervio y en algunas células periféricas del propio nervio. No se observó reacción alguna en ninguno de los controles negativos llevados a cabo paralelamente.
A la vista de estos resultados parece quedar demostrado que en los animales tratados con FK es menor la aparición de timocitos y células T periféricas con respecto a los animales controles (no tratados con FK).
En las secciones procedentes de los animales control el inmunomarcaje positivo contra MHC de clase 1 se observó preferentemente en la zona en la que se encuentran los grupos de sutura y formando una estructura en forma de entramado en el interior del nervio ciático tanto en la región medial como en las proximales y distales. Asimismo esta distribución se observó tanto en los animales de 5 semanas como en los de 11.
En los nervios ciáticos procedentes de animales tratados durante 5 y 11 semanas con FK la reacción presentó una distribución semejante, asociada a los puntos de sutura y formando un entramado de naturaleza reticular en el interior de las secciones transversales de los nervios ciáticos. La distribución de la reacción inmunohistoquímica positiva fue semejante en las secciones medial, proximal y distal del nervio ciático. No se observó reacción alguna en ninguno de los controles negativos llevados a cabo paralelamente.
A la vista de estos resultados puede decirse que el tratamiento con FK hace disminuir la reacción contra MHC de clase 1 con respecto a los animales control.
La observación microscópica de la distribución inmunohistoquímica contra este antígeno en los animales control reveló una reacción positiva alrededor de los puntos de sutura, así como en el interior del nervio ciático en la región medial operada tanto de forma reticular como en numerosas células. En las regiones proximal y distal la reacción inmunohistoqímica fue mucho más débil.
En los nervios procedentes de los animales tratados con FK tras la operación la reacción inmunohistoquímica contra este antígeno resultó mucho más débil tanto a nivel de los puntos de sutura como en el interior del propio nervio. Sin embargo, es de destacar que en los animales tratados durante 5 semanas con FK la reacción fue algo más intensa que en aquellos tratados con el inmunosupresor durante 11 semanas, en los que la reacción tuvo una distribución a modo de enrejado o en algunas células dispersas débilmente inmunomarcadas.
No se observó reacción alguna en ninguno de los controles negativos llevados a cabo paralelamente. Parece deducirse a la vista de estas observaciones que en los animales tratados con FK la aparición de subpoblación de las células T periféricas, la mayor parte de las NK y los leucocitos granulares intraepiteliales es menor que en aquellos animales control.
La observación microscópica del marcaje inmunohistoquímico contra este anticuerpo reveló una reacción positiva fuerte asociada a la periferia de los puntos de sutura y en el interior del nervio ciático tanto en la zona medial como en la zona distal del propio nervio. Los resultados observados fueron semejantes en los animales de 5 semanas y en aquellos de 11.
En las muestras histológicas del material procedente de animales tratados con FK la reacción inmunohistoquímica contra este antígeno fue más débil, observándose algo de positividad en torno a los puntos de sutura y en el interior del propio nervio. No se observó reacción alguna en ninguno de los controles negativos llevados a cabo paralelamente.
Queda demostrado con estos resultados experimentales que la población de células T periféricas (T-helper) y macrófagos es menor en los animales tratados con FK y que el tratamiento prolongado (11 semanas) hace que disminuya aún más la aparición de estas estirpes celulares.
En los animales control tanto de 5 como de 11 semanas la reacción inmunohistoquímica positiva contra este antisuero es intensa tanto en los puntos de sutura como en el interior del propio nervio ciático, tanto en la región medial como en la proximal y distal.
En los nervios ciáticos procedentes de los animales tratados con un inmunosupresor la reacción inmunopositiva frente a este antisuero resulta más débil si se compara con el grupo precedente. La reacción es débil en las zonas de las suturas y en las regiones medial, proximal y distal. Aparentemente no se aprecian diferencias entre el marcaje observado a las 5 y a las 11 semanas de tratamiento experimental. No se observó reacción alguna en ninguno de los controles negativos llevados a cabo paralelamente.
A la vista de los resultados experimentales observados parece poder concluirse que el tratamiento con FK (5 y 11 semanas) hace que disminuya la aparición de macrófagos, granulocitos y células dendríticas con respecto a los animales controles no tratados.
En las muestras procedentes de los animales no sometidos a tratamiento con FK la reacción inmunocitoquímica contra este antisuero se observa en numerosas células dispersas por el propio nervio ciático como asociadas o rodeando a los puntos de sutura, no observándose diferencias significativas entre el marcaje observado a las 5 y 11 semanas.
En las muestras procedentes de los animales tratados con FK la reacción es más débil que en el grupo de animales control, apareciendo cierta reacción alrededor de los puntos de sutura y cierta reacción inmunopositiva dispersa en el interior del nervio. No se observó reacción alguna en ninguno de los controles negativos llevados a cabo paralelamente. Por tanto puede decirse que el tratamiento con FK produce una disminución en el marcaje específico contra este antígeno.
La observación de las cortes histológicas a nivel de la microscopia óptica nos ha permitido poner de manifiesto ligeras diferencias entre unas muestras y otras. En las muestras procedentes de los animales control (no tratados con el inmunosupresor) se observan numerosas células de naturaleza macrofágica entre los paquetes de fibras mielínicas. Asimismo, en estas muestras se observa cierta desorganización en las fibras nerviosas. Estas observaciones aparecen tanto en la región medial operada como en las secciones proximal y distal del correspondiente nervio ciático.
La observación de las muestras histológicas pertenecientes a aquellos animales operados y sometidos posteriormente al tratamiento con un inmunosupresor nos ha permitido poner de manifiesto que histológicamente la estructura del nervio se mantiene en excelentes condiciones tanto a nivel del propio nervio ciático como en la envuelta conjuntiva que lo rodea. A este nivel pueden observarse también algunas estructuras celulares de naturaleza macrofágica, aunque en menor número que el observado en los animales control, generalmente asociadas a los numerosos vasos sanguíneos que se encuentran en el interior de la sección transversal del nervio. Las regiones proximal y distal presentan una características histológicas semejantes a las observadas en la región medial de los animales tratados: una buena conservación de la estructura histológica y un número relativamente escaso de células de naturaleza macrofágica. En estas regiones son numerosos los vasos sanguíneos que discurren paralelos a la dirección del nervio ciático.
La evidencia de regeneración electrofisiológica se observó a los 3 meses en 26 de las 30 ratas tratadas con FK-560. Por el contrario, en sólo nueve de las 30 ratas control en el mismo tiempo se apreció regeneración en el mismo período de tiempo. La media en la conducción nerviosa del nervio ciático fue de 42,5 metros/segundo (DS: 3,9). La media de velocidad de conducción motora a los 3 meses en los animales que recibieron inmunosupresión con FK fue de 26,1 metros/segundo (DS: 5,0), con una diferencia significativa (p < 0,05) respecto a la conducción media de 18,1 metros/segundo (DS: 4,6) en los animales control. La diferencia en la velocidad de conducción entre los dos grupos no fue evidente hasta que la regeneración tuvo lugar entre las 8 y 10 semanas. Una diferencia similar, pero más pronunciada, se apreció en las amplitudes de los potenciales de la acción muscular. La amplitud media preoperatoria fue de 10,7 mV (DS: 1,9). A los 3 meses del postoperatorio la amplitud media en los animales tratados con FK fue de 3,8 mV (DS: 1,8), mientras que en los animales control fue de 1,7 mV (DS: 1,1). La diferencia es significativa (p < 0,01).
Discusión
Durante mucho tiempo la regeneración del tejido nervioso periférico ha sido motivo de investigación y controversia. Desde que Waller,20 hace más de 1 siglo, describió la regeneración nerviosa en una fibra lesionada y su posterior regeneración desde el extremo proximal del nervio afectado, han sido muchos los científicos que han profundizado en este aspecto y numerosos los procedimientos conservadores y quirúrgicos que se han ido desarrollando a lo largo de este tiempo en un intento de hallar una recuperación del tejido nervioso periférico lesionado.
Superada la idea de que los nervios podían regenerar espontáneamente y que su manipulación podría impedir su funcionalidad, no es hasta mediados del siglo XIX cuando comienza a aceptarse la reparación de un nervio periférico lesionado mediante la sutura de su tejido conjuntivo.
Es en este último siglo cuando se producen avances significativos en el desarrollo de la cirugía, perfeccionándose técnicas quirúrgicas concretas que posteriormente, y ya en los últimos años, se han asociado a medidas capaces de acelerar la regeneración axonal tales como el empleo de sustancias neurotróficas o cultivos de células de Schwann8,21 o la aplicación de campos electromagnéticos pulsátiles.14
Sin embargo, en los últimos años se ha visto incrementado el número de accidentes y lesiones traumáticas que han originado a su vez un aumento en la necesidad de disponer de tejido nervioso adicional para hacer frente a defectos de magnitud y extensión importantes. En esta línea, cirujanos como Barnes y cols.,2Guttman y Guttman5 y Seddon17 realizaron experimentos trasplantando nervio periférico tanto en animales como en humanos ya a mediados de nuestro siglo.
Habiendo definido Hubbel7 con anterioridad el autoinjerto como material ideal para el trasplante, fue, sin embargo, mayor el incremento en la experimentación en aloinjertos debido a la imposibilidad de que un mismo individuo pudiera disponer de material suficiente para hacer frente a defectos importantes del tejido. Por ello, tras importantes avances en el tratamiento conservador y quirúrgico del nervio periférico, en la actualidad el trasplante alogénico de tejido nervioso periférico, además de ocupar un papel esperanzador y relevante en el tratamiento de su patología, puede ser considerado como el tratamiento con mayores expectativas de futuro en nuestros días.
Sin embargo, la regeneración nerviosa esperada tras un trasplante con frecuencia se ha relacionado con fenómenos de rechazo que ya Mackinon y cols.12 defendieron como responsables del fallo del aloinjerto, el cual mostraba una reacción inflamatoria difusa y una fibrosis secundaria que fueron atribuidas a una reacción inmune del huésped. Es, por tanto, la posibilidad de rechazo la principal amenaza del éxito del trasplante alogénico y es por ello que en los últimos años se han estudiado y propuesto múltiples procedimientos encaminados a disminuir o hacer desaparecer el rechazo del tejido trasplantado. En la presente investigación las fibras nerviosas no sometidas a tratamiento inmunosupresor muestran acúmulos de células linfoides en su interior, así como de naturaleza macrofágica, y sus fibras se hallan desgajadas y separadas de su envuelta conjuntiva, a diferencia de las tratadas, cuya estructura se mantiene en perfectas condiciones.
En el año 1943, en un intento de disminuir la capacidad antigénica del injerto, Weiss22 inició las primeras técnicas de preservación de aloinjertos mediante el uso de la liofilización. Posteriormente, Marmor13 utilizó la irradiación previa y Afanesieff,1 años después, los aloinjertos preservados en solución de cialita. En el mismo ámbito diversos investigadores ahondaron en el campo de la inmunología en un intento de incrementar las defensas del receptor o minimizar la reacción inmunológica de rechazo, por ejemplo, mediante el descubrimiento por Dausset,3 en 1958, de los marcadores antigénicos tisulares o sistema HLA, lo que ha permitido hacer una mejor selección de donantes y receptores.
Otros científicos intentaron con diversos procedimientos debilitar o anular el rechazo de los trasplantes utilizando la irradiación corporal subletal y los corticoides. Pocos años después se comenzó a emplear la 6-mercaptopurina como droga inmunosupresora entre los recursos posibles para inhibir el rechazo, lo que constituyó la base de la inmunodepresión con fármacos. Posteriormente esta droga fue reemplazada por la azatioprina, un análogo de la 6-mercaptopurina. Estos agentes tenían la capacidad, al administrarse con los corticoesteroides, de actuar de forma sinérgica interfiriendo con distintas fases de la respuesta inmune.
Entre las adquisiciones más recientes e importantes destaca el empleo de anticuerpos monoclonales como agentes inmunosupresores y el descubrimiento de la CyA y considerada hasta hace poco como la droga inmunosupresora más importante de todos los tiempos.
Con estos hallazgos e investigaciones, que comienzan a mediados del siglo pasado, podemos concluir que siendo insuficiente la fuente de material nervioso autólogo en el ser humano, queda establecido el aloinjerto de nervio periférico como la estructura ideal para reparar lesiones de este tejido. Sin embargo, histológicamente, a pesar de que todos los alotrasplantes nerviosos presentan un inicio de regeneración en su fase temprana, siempre están abocados al fracaso, que se produce por una importante
reacción inflamatoria de predominio linfocítico que conduce a la necrosis, fibrosis secundaria y fallo subsecuente. Es por esta razón por la que se hace necesario disminuir o anular la respuesta inmune del receptor frente al injerto. En el estudio que nos ocupa ya se ha mencionado que las muestras no tratadas presentan una importante reacción inflamatoria, así como desestructuración de sus fibras, no habiéndose observado fibrosis secundaria ni fallo subsecuente.
Por otro lado sabemos que este defecto depresor de la inmunidad se ha obtenido con algunos fármacos y ha sido aplicado en anteriores trasplantes alogénicos de nervio. Sin embargo, dado que los efectos adversos de estas drogas, incluida la CyA, han superado a las ventajas en este tipo de trasplantes, su utilización en el hombre en este caso no ha sido aconsejable.
El descubrimiento en 1984 de un nuevo inmunosupresor de gran actividad, identificado inicialmente con el número de código del laboratorio como FK-506 y denominado posteriormente con el nombre genérico de tracolimus, ha mejorado considerablemente las expectativas del trasplante de órganos, demostrando un avance importante con respecto a la terapia convencional con CyA en el sentido de que reduce la incidencia de rechazo, que es la principal complicación postrasplante. Estos resultados alentadores han sido obtenidos experimentalmente en diversos órganos y tejidos y en ensayos clínicos en trasplante de hígado, riñón y corazón. Presenta además este fármaco un amplio margen de seguridad, con menor incidencia de complicaciones infecciosas, hipertensión e hiperlipidemia, no constatándose tampoco evidencia de hiperplasia gingival o ginecomastia y posibilitando un uso más bajo de corticosteroides orales.
La característica clave de FK-506 es su capacidad para inhibir específicamente la producción de interleukina-2 y la activación de los receptores de interleukina-2 en las células T. Los estudios realizados demuestran que el efecto inmunosupresor in vitro es 100 veces más potente que la terapia anterior estándar con CyA, y en estudios con animales FK-506 es eficaz inhibiendo la proliferación de linfocitos con dosis de 10 a 100 veces inferiores de CyA.15
La similitud entre el mecanismo de acción y los efectos celulares de FK-506 y CyA es sorprendente dadas las diferencias en su estructura química.6 Ambos agentes actúan en las primeras fases del proceso de activación de las células T.19Como consecuencia, el efecto antiproliferativo de FK-506 sólo se observa in vitro si se administra el medicamento durante las primeras horas después del estímulo que desencadena la activación de las células T. Cuando se administra durante la primera hora después de la activación bloquea totalmente la proliferación de las células T y todos los eventos posteriores asociados con la función de estas células. Sin embargo, un retraso de 6 horas entre el estímulo activador y la administración del fármaco hace que éste tenga muy poco efecto sobre la proliferación de dichas células T.16 En nuestro estudio la droga inmunosupresora es aplicada al concluir la cirugía del trasplante y posteriores dosis son administradas en días sucesivos, pudiéndose observar un inmunomarcaje para linfocitos T más débil en los nervios tratados con FK-506 que en aquellos no tratados, lo cual verifica la actividad antiproliferativa de esta droga sobre las células T en el tejido nervioso trasplantado, probablemente en relación a su administración temprana.
Correspondencia:
Dr. J. A. DE PEDRO MORO.
Hospital Clínico.
28000 Madrid.o de 1997.
*.Premio Mauricio Riosalido 1997.
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