La candidiasis es una de las micosis más importantes entre las frecuentes infecciones invasivas por hongos en pacientes hospitalizados; por esta razón, el tratamiento antifúngico es un desafío constante.
ObjetivosEste estudio evaluó la sensibilidad in vitro de aislamientos clínicos de Candida albicans procedentes de hemocultivos a fluconazol, anfotericina B y anidulafungina, aislados en un hospital del sur de Brasil.
MétodosPara los estudios de sensibilidad in vitro se testaron 153 aislamientos de C. albicans frente a los fármacos mencionados, en concordancia con el Clinical and Laboratory Standards Institute. Se determinaron las concentraciones inhibitorias y fungicidas mínimas (CMI y CMF, respectivamente) de cada fármaco y el punto de corte epidemiológico (ECV).
ResultadosTodas las cepas fueron susceptibles a anidulafungina, con la CMI y CMF≤1μg/ml; sin embargo, cuando se comparó con el ECV, un 3% de los aislamientos presentó valores más altos. Con relación al fluconazol, un 96% fue sensible, un 3%, susceptible dependiente de la dosis, y un 1%, resistente. Sin embargo, se observó que el 21% de los aislamientos presentó valores mayores que el ECV. Bajo la acción de la anfotericina B, una de las cepas fue resistente y, el resto, susceptible, de acuerdo con la CMF; por otro lado, un 1,5% de los aislamientos presentó valores mayores al ECV.
ConclusionesLos aislamientos de C. albicans presentaron mayor sensibilidad a la anidulafungina y un 90% de estas cepas (CMI90) presentó los menores valores frente a la anfotericina B. Basados en el ECV y la nueva clasificación descrita por Pfaller, los aislamientos podrían ser resistentes a fluconazol, lo que demuestra la importancia de la asociación y revisión de estos parámetros.
Candidiasis is one of the most important among recurrent invasive yeast infections in patients, thus antifungal treatment becomes a challenge.
AimsThe aim of this study was to evaluate the in vitro activity of clinical Candida albicans isolates from blood cultures to fluconazole, amphotericin B and anidulafungin, in a hospital from Rio Grande do Sul, Brazil.
MethodsThe susceptibility of 153 isolates to the 3 drugs mentioned was tested according to Clinical and Laboratory Standars Institute. Minimal inhibitory and fungicidal concentrations (MIC, MFC, respectively) of each drug were determined, as well as the epidemiological cutoff value (ECV).
ResultsAll of the isolates were susceptible to anidulafungin, MIC and MFC≤1μg/ml; however, when compared with ECV, 3% of the isolates exhibited higher values against fluconazole, 96% were susceptible, 3% susceptible dose-dependent, and 1% resistant. Also, it was observed that 21% of the isolates exhibited higher values than ECV. One isolate was resistant to amphotericin B; the other ones, susceptible, based on the MFC; furthermore, 1.5% of the isolates exhibited higher values.
ConclusionsC. albicans isolates exhibited more susceptibility to anidulafungin, and 90% of them (MIC90) exhibited the lowest values against amphotericin B. Based on ECV and Pfaller classification, isolates could be resistant to fluconazole, demonstrating the importance of the combination of these parameters.
Las infecciones invasivas por hongos en pacientes hospitalizados son frecuentes a causa de la inmunosupresión, del uso prolongado de antibióticos o corticosteroides, de la nutrición parenteral y de los procedimientos invasivos; en consecuencia, una alta tasa de mortalidad es observada1,11,13.
La candidiasis es una micosis cutánea o sistémica, causada por Candida y clasificada como el cuarto tipo de infección que afecta al tejido sanguíneo, lo que contribuye al aumento de la morbimortalidad, de los costes y del tiempo de hospitalización3,22.
En las unidades de cuidados intensivos (UCI), las candidemias constituyen un grave problema, debido a que la permanencia prolongada de los pacientes en las mismas trae como consecuencia la colonización por Candida, principalmente Candida albicans11. Recientemente, un estudio realizado en Brasil describió que C. albicans es la principal especie en episodios de candidemia4.
La gran mayoría de los aislamientos clínicos de C. albicans es sensible a fluconazol; sin embargo, se puede observar resistencia clínica durante el tratamiento9,15,18,23. La anfotericina B es un antifúngico poliénico ampliamente utilizado en la práctica clínica, a pesar de su elevada toxicidad3. Así, en 2005, surgió una nueva alternativa terapéutica para el tratamiento y la prevención de la candidiasis: la anidulafungina, una de las equinocandinas aprobada por la United States Food and Drug Administration (FDA)16, que ha demostrado ser más eficaz que el fluconazol23.
La anidulafungina se diferencia de las otras equinocandinas en que no se metaboliza en el hígado, su degradación es química, posee un volumen de distribución equivalente al volumen acuoso total corporal y una semivida biológica más larga que sus congéneres. Diversos estudios muestran una excelente actividad in vitro de este antifúngico sobre Candida, con valores de concentración mínima inhibitoria (CMI) menores que los obtenidos con la caspofungina y la micafungina10,12,16.
El objetivo de este estudio fue evaluar la sensibilidad in vitro a fluconazol, anfotericina B y anidulafungina de aislamientos clínicos de C. albicans procedentes de hemocultivos.
Materiales y métodosAislamientosSe utilizaron 153 aislamientos de C. albicans procedentes de hemocultivos procesados de 1999 a 2009 en el Hospital Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil. Las muestras fueron identificadas por el método semi-automatizado ID 32C® (bioMérieux, Marcy-l’Etoile, Francia) y almacenadas en agua destilada a -20°C hasta el momento de realizar el presente estudio.
FármacosLa anfotericina B (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE. UU.), la anidulafungina y el fluconazol (Pfizer, Inc., New York, NY, EE. UU.) fueron obtenidos en polvo estándar a través del fabricante, y preparados de acuerdo con el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) en su documento M27-A35,6.
Prueba de sensibilidad antifúngicaLa prueba de microdilución en caldo se realizó de acuerdo con el CLSI M27-A3, y se utilizó el inóculo con una concentración final de 1,5±1,0×103cél/ml en medio RPMI-1640, incubado a 35°C durante 24 - 48h. La CMI se determinó por la concentración más baja capaz de producir la disminución de la turbidez en comparación con el control positivo de los fármacos (fluconazol y anidulafungina≥50% y anfotericina B≥90%). La concentración mínima fungicida (CMF), realizada para pruebas con anfotericina y anidulafungina, se determinó mediante el subcultivo de 10μL de cada pocillo de la microplaca que presentó ausencia de turbidez, en placas que contenían agar Sabouraud con posterior incubación a 35°C durante 48h.
Análisis de los resultadosSe realizó la media geométrica de las CMI y CMF de cada fármaco, así como determinar la concentración capaz de inhibir el 50% y el 90% de los aislamientos. Se establecieron puntos de corte clínicos (CBP) de acuerdo con el CLSI5,6 para el fluconazol (aislamientos sensibles: CMI≤8μg/ml; de 16 a 32μg/ml, aislamientos sensibles con dependencia de la dosis, y≥64μg/ml, resistentes), anidulafungina (≤2μg/ml, sensibilidad, y>2μg/ml, aislamientos no sensibles) y anfotericina B (≤1μg/ml, aislamientos sensibles, y≥2μg/ml, resistentes). También se evaluaron los CBP de acuerdo con Pfaller et al.15,19,21, que describieron que concentraciones<1 y≥1μg/ml de anfotericina B son consideradas de sensibilidad y resistencia, respectivamente. Con relación al fluconazol, cepas con concentraciones≤2μg/m son consideradas sensibles, con 4μg/ml, sensibles dependientes de la dosis, ycon≥8μg/ml, resistentes. Para la anidulafungina, los aislamientos con valores ≤2 mg/ml son considerados sensibles, con 4 mg /ml intermedios, y resistentes a partir de 8 mg /ml. Por otra parte, se obtuvieron los puntos de corte epidemiológicos (ECV) para los fármacos utilizados, de acuerdo con Turnidge et al.24, que consideran la distribución de la CMI obtenida, la moda de la CMI de cada uno de los fármacos y la variabilidad de la prueba. En general, el ECV es aproximadamente 2 diluciones sobre la moda, y abarca un 95% de los valores de la distribución de la CMI obtenidos. Estos ECV son medidas sensibles para valorar aislamientos emergentes con menor sensibilidad a los mencionados fármacos.
ResultadosEl número de aislamientos de C. albicans de hemocultivos obtenidos durante 10 años de estudio (1999 a 2009) y su sensibilidad a cada uno de los antifúngicos utilizados en este trabajo, de acuerdo con los valores CMI y ECV, se describen en la tabla 1.
Sensibilidad de los aislamientos de C. albicans obtenidos de hemocultivos, frente a anfotericina B, anidulafungina y fluconazol, en el periodo de 1999 a 2009
| Fármacos (ECV μg/ml) | Año | n | CMI (μg/ml) | |
| Rango | Moda | |||
| Anfotericina B (1μg/ml) | 1999 | 2 | 0,015-0,03 | - |
| 2000 | 4 | 0,125-0,25 | 0,125 | |
| 2001 | 3 | 0,03-0,125 | 0,03 | |
| 2002 | 6 | 0,03-0,25 | 0,125 | |
| 2003 | 3 | 0,03-0,125 | 0,03 | |
| 2004 | 1 | 0,25 | - | |
| 2005 | 20 | 0,003-0,25 | 0,03 | |
| 2006 | 42 | 0,015-0,5 | 0,06 | |
| 2007 | 25 | 0,003-0,25 | 0,03 | |
| 2008 | 22 | 0,03-0,25 | 0,06 | |
| 2009 | 25 | 0,03-0,25 | 0,06 | |
| Anidulafungina (1μg/ml) | 1999 | 2 | 0,003 | - |
| 2000 | 4 | 0,003-0,06 | 0,015 | |
| 2001 | 3 | 0,03-0,125 | 0,03 | |
| 2002 | 6 | 0,003-0,125 | 0,007 | |
| 2003 | 3 | 0,03-0,125 | 0,03 | |
| 2004 | 1 | 0,003 | - | |
| 2005 | 20 | 0,0015-0,06 | 0,003 | |
| 2006 | 42 | 0,0015-0,5 | 0,003 | |
| 2007 | 25 | 0,003-0,25 | 0,015 | |
| 2008 | 22 | 0,003-0,25 | 0,125 | |
| 2009 | 25 | 0,003-0,125 | 0,06 | |
| Fluconazol (1μg/ml) | 1999 | 2 | 0,125-0,25 | - |
| 2000 | 4 | 0,125-0,5 | 0,25 | |
| 2001 | 3 | 0,125-0,25 | 0,125 | |
| 2002 | 6 | 0,25-4 | 0,5 | |
| 2003 | 3 | 0,25-0,5 | 0,25 | |
| 2004 | 1 | 0,5 | - | |
| 2005 | 20 | 0,125-64 | 0,25 | |
| 2006 | 42 | 0,125-16 | 0,125 | |
| 2007 | 25 | 0,125-8 | 0,125 | |
| 2008 | 22 | 0,125-2 | 0,125 | |
| 2009 | 25 | 0,125-8 | 0,125 | |
CMI: concentración mínima inhibitoria; ECV: puntos de corte epidemiológicos.
Los valores de las CMI y CMF de los fármacos: fluconazol, la anfotericina B y la anidulafungina frente a los aislamientos de C. albicans se describen en la tabla 2. Cuando se compararon los resultados del promedio geométrico de las CMI de los 3 fármacos, se pudo observar que el valor más bajo se obtuvo para la anidulafungina; sin embargo, el valor más bajo de CMI90 fue observado para la anfotericina B, y el valor mayor para el fluconazol. Al mismo tiempo, con relación al CMF90, no se observó ninguna diferencia entre la anfotericina B y la anidulafungina. Por otro lado, el fluconazol es clasificado como fungistático.
Sensibilidad (μg/mL) in vitro de 153 aislamientos de Candida albicans frente a anfotericina B, anidulafungina y fluconazol
| Antifúngico | CMI (μg/ml) | CMF (μg/ml) | ||||||
| MG | Rango | CMI50 | CMI90 | MG | Rango | CMF50 | CMF90 | |
| Fluconazol | 0,4 | 0,125 a 64 | 0,25 | 2 | – | – | – | – |
| Anfotericina B | 0,06 | 0,003 a 0,5 | 0,06 | 0,03 | 0,12 | 0,003 a 2 | 0,125 | 0,25 |
| Anidulafungina | 0,017 | 0,0015 a 0,5 | 0,015 | 0,125 | 0,05 | 0,0015 a 1 | 0,06 | 0,25 |
CMF: concentración mínima fungicida; CMI: concentración mínima inhibitoria; MG: media geométrica; –: prueba no realizada debido a que el fluconazol es clasificado como fungistático.
De acuerdo con el CLSI5,6, todas las cepas fueron sensibles a la anidulafungina, con la CMI y la CMF≤1μg/ml. No obstante, cuando se comparó con el ECV, un 3% (n=4) de los aislamientos presentó valores más altos. En relación con el fluconazol, un 96% (n=148) fue caracterizado como sensible, un 3% (n=4), como sensible dependiente de la dosis, y un 1% (n=1), como resistente. Asimismo, se observó que un 21% (n=31) de los aislamientos presentó valores mayores que el ECV. Con relación a la anfotericina B, todos los aislamientos fueron susceptibles; solo un aislamiento se caracterizó como resistente en base a la concentración fungicida. Además, el 1,5% (n=2) de los aislamientos presentó valores mayores a los valores de ECV.
Cuando se utilizó la clasificación hecha por Pfaller et al.15,19,21, todas las cepas resultaron sensibles a la anidulafungina. Con relación a la anfotericina B y al fluconazol, hubo cambios en la clasificación de las cepas. La comparación valores obtenidos con de los antifúngicos de acuerdo con Pfaller et al.15,19,21 y el CLSI5,6 arrojó diferencias estadísticamente significativas en la prueba de chi-cuadrado de Pearson, con p=0,035 (tabla 3).
Valores obtenidos con los antifúngicos ensayados, clasificados en sensibles, intermedios, sensibles-dosis dependiente y resistentes, de acuerdo con Pfaller et al. y el Clinical and Laboratory Standards Institute
| Antifúngicos | Sensible (n) | Intermedio/SSD (n) | Resistente (n) | |||
| A | B | A | B | A | B | |
| Fluconazol | 141 | 148 | 3 | 4 | 9 | 1 |
| Anidulafungina | 153 | 153 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Anfotericina B | 151 | 152 | - | - | 2 | 1 |
El uso de las pruebas de sensibilidad antifúngica in vitro tiene como finalidad detectar aislamientos de Candida potencialmente resistentes. De este modo, constituye una ayuda en el tratamiento rápido y eficaz de la candidiasis16. El CBP se utiliza para indicar cuáles de los aislamientos responden comúnmente al tratamiento con la dosis recomendada de cada fármaco, mientras que el ECV se puede utilizar como una medida más sensible para las cepas emergentes con una menor sensibilidad al fármaco utilizado15 y, de esta manera, la respuesta clínica puede ser diferente de lo esperado.
La mayoría de los aislamientos (96%) fueron sensibles al fluconazol; sin embargo, cuando se utilizó el ECV, un 21% de los aislamientos presentó una menor sensibilidad, lo cual no se puede observar por medio del CBP. Un porcentaje similar han observado Pfaller et al.15; según los autores, un 15% de los aislamientos presentó valores de CMI mayores que el ECV; por otro lado, la mayoría de los estudios utiliza el CBP8,10–12, con lo cual, se observan resultados similares a los obtenidos en nuestra investigación, que describe a la mayoría como sensibles, y a un 5% de los aislamientos como resistentes al fluconazol.
Solo un aislamiento fue resistente al fluconazol. Frente a la anidulafungina, presentó una CMI de 0,003μg/ml, una de las concentraciones más bajas, que demostró, así, la alta eficacia de esta equinocandina. Pfaller et al.20 realizaron una prueba con 41 aislamientos resistentes a fluconazol. La CMI90 frente a la anidulafungina fue de 0,06 mg/ml, sin que se encontrara resistencia cruzada entre ambos antifúngicos, aunque no se ha confirmado que esta resistencia no exista16. El fluconazol, como todos los azoles, actúa inhibiendo la enzima lanosterol 14-α-desmetilasa del citocromo P450, que convertiría el lanosterol en ergosterol, un constituyente de la membrana celular de los hongos. La resistencia observada en nuestro estudio puede haber tenido lugar por la cantidad y calidad del lugar de unión de la enzima o por la reducción del acceso del fármaco a este lugar. Además, existe la posibilidad de la mutación del gen que codifica el lugar de unión de la enzima, con lo que disminuye la afinidad al fluconazol, y su sobreexpresión resultaría en la necesidad de altas concentraciones del fármaco para inhibir la presencia de la enzima en el interior de la célula. Otra posibilidad sería la salida del fármaco por las bombas de eflujo presentes en el hongo14,15.
Con relación a la anidulafungina, todos los aislamientos fueron sensibles de acuerdo con el CBP (tabla 1), mientras que el 3% de estos presentaron una menor sensibilidad según el ECV. La resistencia a las equinocandinas ha sido relatada en aislamientos de C. albicans, C. tropicalis y C. krusei, resultante de la mutación en la subunidad Fksp de la enzima β-(1,3)-D-glucano sintasa, sin la necesidad de que la CMI sea mayor de 2μg/mL en estos aislamientos2,14,16,20. Además, la menor sensibilidad in vitro a las equinocandinas y el fracaso clínico no siempre están vinculados13.
Varios estudios han tratado de determinar la sensibilidad de los aislamientos de Candida a las equinocandinas; en ellos, la mayoría de los valores encontrados fluctuaban entre 0,03 y 0,06μg/mL12,16-18,20,23, lo que coincide con los resultados de este estudio. Pfaller et al.16 describen que un 1,2% de los aislamientos de C. albicans de hemocultivos podrían ser resistentes a anidulafungina cuando se utiliza el ECV, de acuerdo con lo que se observó en este estudio. Por lo tanto, se podría predecir qué aislamientos podrían responder de manera diferente a lo esperado durante el tratamiento.
Todos los aislamientos fueron sensibles a anfotericina B, mientras que en el CMF solo uno fue resistente de acuerdo con Pfaller et al.21, lo que coincide también con Boff et al.3, que demostraron la sensibilidad de C. albicans a ese fármaco por la CMI y la CMF. Cuando se utilizó el ECV, un 1,5% de los aislamientos presentó valores mayores. Pfaller et al.21 describieron un valor de ECV mayor (2μg/ml) que en nuestro estudio. La resistencia a la anfotericina B puede estar asociada con el aumento o disminución de los esteroles de la membrana o, incluso, con la producción de proteínas y enzimas fúngicas que actuarían en el fármaco7, lo que puede explicar el fracaso del tratamiento.
Pfaller et al.15,19,21 han descrito diferencias en los CBP utilizados por CLSI5,6; esto también se observó en nuestro estudio, con diferencia estadística y p=0,035 (tabla 3).
Con estos nuevos CBP, que son específicos de especie, se pueden identificar aislamientos resistentes y que fueron previamente catalogados como sensibles, con un resultado satisfactorio en el tratamiento15,19. De esta manera, deberían considerarse estos nuevos CBP en los CLSI.
La mayoría de los estudios sobre la sensibilidad in vitro solo utiliza la CMI y, en comparación con este estudio, los aislamientos de C. albicans serían sensibles a anfotericina B1,4,8,11,12. No obstante, a través de la CMF, un aislamiento sería resistente, lo que demuestra la importancia de esta evaluación. Cuando se testó el aislamiento resistente a la anfotericina B frente a la anidulafungina, se observó que era sensible y presentaba la concentración más baja (0,0015μg/ml). Pfaller et al.21 y Rambach et al.22 utilizaron, además del CBP, el cálculo del ECV, lo que demostró la importancia del seguimiento de especies con sensibilidad reducida.
Utilizar solamente el valor de CMI elevado para definir la resistencia frente a un fármaco no es suficiente, es necesario tener en cuenta las características de la posible mutación del gen de la resistencia, lo que es posible a través del ECV.
ConclusiónCon los resultados de este trabajo se concluyó que los aislamientos de C. albicans presentan mayor sensibilidad a anidulafungina; sin embargo, los valores más bajos obtenidos en el 90% de los aislamientos (CMI90) se deben a la acción de la anfotericina B. Asimismo, a través del ECV y la nueva clasificación descrita por Pfaller, los aislamientos podrían ser resistentes a fluconazol, lo que demuestra la importancia de la asociación y revisión de estos parámetros.
Conflicto de interesesLos autores declaran que no hay conflicto de intereses.
Los autores agradecen a Pfizer Inc. la donación de los fármacos utilizados en este estudio, y a la Coordinación de Perfeccionamiento de Personal de Nivel Superior (CAPES), la beca de doctorado del primer autor.
Ese manuscrito es parte de la tesis de doctorado del primer autor.
