INTRODUCCIÓN
La esterilidad afecta a un 15-20% de las parejas y en aproximadamente la mitad de los casos el defecto es de origen masculino. Aunque se han realizado enormes progresos en la comprensión de la fisiología del espermatozoide y de los mecanismos de su interacción con el óvulo, todavía queda por aclarar qué pruebas sirven para predecir de forma exacta el funcionamiento del espermatozoide.
El análisis del semen sigue siendo la prueba clínica de laboratorio más importante de que se dispone para la evaluación del factor masculino. Es evidente que el número y la concentración de los espermatozoides, su movilidad y su normalidad morfológica son factores importantes que determinan el éxito en la consecución de un embarazo, tanto in vivo como in vitro1. Aunque el análisis del semen constituye un pilar esencial para la evaluación de la esterilidad, en muchos casos no permite detectar la presencia de alteraciones sutiles en el espermatozoide. Se considera que aproximadamente un 15% de los varones estériles presenta un espermiograma dentro la más completa normalidad2.
Es posible que los parámetros sistemáticos del semen no siempre sean indicativos de la calidad de la ADN del espermatozoide. Los pacientes pueden tener espermiogramas normales y seguir siendo estériles. La causa de la infertilidad puede ser debida a la presencia de un ADN anómalo espermático, factor que no se mide de forma sistemática. La integridad del ADN en el espermatozoide se puede considerar como un parámetro independiente e indicativo de la calidad de éste.
La importancia de la cromatina del espermatozoide se pone más de manifiesto cuando se utilizan técnicas de reproducción asistida en parejas estériles. La principal desventaja de estas técnicas es que constituyen una forma de evitar la barrera de selección natural que ocurre de forma normal en los tractos reproductivos masculino y femenino, desde la eyaculación hasta que el espermatozoide penetra el óvulo. La naturaleza proporciona de forma natural múltiples obstáculos, de forma que sólo el espermatozoide más apto llega a alcanzar y a fecundar el óvulo. Los espermatozoides genéticamente dañados pueden ser capaces de fertilizar cuando se inyectan de manera directa dentro del oocito3. Si el ADN del espermatozoide presenta lesiones, puede dar lugar a un desarrollo anómalo embrionario, a un fallo de implantación o incluso a un aborto en fases más tardías. Cuando el daño del ADN espermático es compatible con vida, puede dar lugar a un niño con diversas anomalías. La determinación de los parámetros sistemáticos del semen no aporta información acerca de la calidad del espermatozoide, especialmente en las técnicas de reproducción asistida. Así pues, puede resultar prudente determinar si hay daño en el ADN de pacientes estériles, especialmente en los casos en los que los parámetros sistemáticos no hayan evidenciado ninguna anomalía obvia y previamente a la utilización de cualquier técnica de reproducción asistida.
LESIONES DEL ADN Y PARÁMETROS SEMINALES SISTEMÁTICOS
La calidad del espermatozoide evaluada mediante los parámetros convencionales seminales (concentración, motilidad, y morfología) se correlaciona con la integridad del ADN4-6. En algunos pacientes estériles, el control de la espermatogénesis puede ser menos eficiente y se pueden producir numerosos espermatozoides inmaduros con restos citoplasmáticos, que son más propensos a producir especies reactivas de oxígeno (ROS) y que se caracterizan por la presencia de anomalías en el ADN7,8. Irvine et al9 describieron una correlación negativa entre la presencia de daño en el ADN del espermatozoide y la calidad del semen9. En otros estudios se ha confirmado que diversas alteraciones en las características del espermatozoide se asocian con un aumento en la proporción de espermatozoides con ADN fragmentado10,11.
MECANISMOS DE LESIÓN EN EL ADN DEL ESPERMATOZOIDE
Normalmente, el ADN del espermatozoide es muy estable gracias a su organización característica12. El origen de la producción de lesiones en el ADN del espermatozoide puede deberse a múltiples causas, como la presencia de una enfermedad, el uso de fármacos, la presencia de fiebre alta, una temperatura testicular elevada, la contaminación atmosférica, el tabaquismo o una edad avanzada. Se han propuesto diversas hipótesis acerca del mecanismo molecular a través del cual se produce el daño en el ADN del espermatozoide. El mecanismo más importante de producción del daño en el ADN del espermatozoide puede ser la presencia de un empaquetamiento anómalo de la cromatina, debido a una protaminación insuficiente, y a la producción de radicales libres de oxígeno (ROS) y apoptosis13,14. La presencia de radicales libres de oxígeno ha merecido una atención especial, tanto por su papel en la fisiología como por su implicación en las enfermedades de la reproducción humana15. La presencia de estrés oxidativo tiene lugar cuando hay una producción excesiva de especies reactivas de oxígeno por parte de los leucocitos o por los espermatozoides anormales y/o se produce una disminución de la capacidad antioxidante del semen. En diversos estudios se ha descrito que la presencia de radicales libres de oxígeno es una causa importante de lesión en el ADN del espermatozoide12,16,17.
LESIÓN DEL ADN Y FERTILIDAD
Se ha demostrado que en la concepción natural, el estado del ADN espermático es esencial para lograr el embarazo18,19. Cada vez hay más evidencia que sugiere que la presencia de daño en el ADN del esper matozoide debería de ser investigada de forma sistemática. Se ha demostrado que la presencia de un empaquetamiento defectuoso de la cromatina se correlaciona con una tasa baja de fertilización, tras fecundación in vitro (FIV) o inyección espermática intracitoplasmática (ICSI)11,20 y con una incidencia más alta de abortos18. La presencia de daño en el ADN también se correlaciona con el éxito de la inseminación intrauterina21. Se ha demostrado también que la presencia de defectos en el genoma masculino conduce a fracasos posfertilización13.
TÉCNICAS DE REPRODUCCIÓN ASISTIDA Y LESIÓN EN EL ADN
Recientemente, la presencia de anomalías en el ADN del espermatozoide ha sido muy destacada debido a diversas publicaciones en las que se correlaciona el grado de lesión con varios índices de fertilidad, como la tasa de fertilización, la tasa de división del embrión, la tasa de implantación, el índice de embarazos y el índice de nacidos vivos.
Si el ADN del espermatozoide no puede decondensarse después de penetrar en el oocito, la fertilización puede fallar o puede tener lugar un fallo posfertilización debido a la presencia de ADN defectuoso espermático, lo que origina un embrión de escasa calidad22. La presencia de abortos podría ser debida a un aumento en el grado de daño en el ADN del espermatozoide. Por tanto, ésta podría ser la causa de los abortos inexplicados en algunas pacientes23. La tasa de embarazos y de nacidos a término después del recurso a técnicas de reproducción asistida también se asocia con la presencia de daño en el ADN del espermatozoide5. Además, el grado en el daño del ADN puede afectar a la capacidad de una pareja para concebir de forma natural18,19.
ADN y embarazo natural
En 2 trabajos se ha examinado la relación entre daño en el ADN del espermatozoide, determinado mediante la técnica del análisis de la estructura cromatínica del espermatozoide (SCSA), y la capacidad de una pareja para concebir18,19. En el estudio de Evenson et al18 se incluyó a 200 parejas con deseo gestacional. Se detectó que la dificultad para concebir se daba en varones que presentaban lesiones en el ADN >= 30%. En otro estudio realizado por Spano et al19 se evidenció que cuando el daño en el ADN es > 20% se observa una disminución de la fertilidad. Cuando el grado de lesión en el ADN sobrepasa el 40%, la probabilidad de conseguir un embarazo es mínima.
DAÑO EN EL ADN Y FECUNDACIÓN IN VITRO
En numerosos estudios se muestra que los daños en el ADN espermático afectan a la fertilización y al embarazo tras la realización de una FIV. Sun et al10 determinaron la fragmentación espermática del ADN mediante el método de TUNEL y hallaron que el 40% de los espermatozoides obtenidos de muestras seminales, procedentes de la consulta de esterilidad, contenía dichas fragmentaciones; asimismo, en la FIV observaron una correlación inversa entre el porcentaje de espermatozoides con fragmentación del ADN y el índice de fertilización e implantación10.
Defectos en la condensación pueden originar una descondensación imperfecta del ADN espermático en el ooplasma, causando así una fecundación defec tuosa24. El grado del daño del ADN espermático podría ser un índice predictivo del éxito en la FIV20.
Henkel et al25 han comunicado que, aunque la frag mentación del ADN no muestra una correlación con el índice de fertilización ni con la fragmentación del embrión, la tasa de gestaciones en la FIV es significativamente más baja cuando los espermatozoides valorados eran positivos para la prueba TUNEL (> 36% espermatozoides positivos)25. Estos estudios apoyan los hallazgos de Twigg et al3, que comunican que un espermatozoide con el ADN dañado puede fertilizar un oocito mediante FIV o ICSI y formar un pronúcleo3. Sin embargo, dependiendo del grado de alteración del ADN, el desarrollo embrionario resulta afectado en fases posteriores y en situaciones severas puede conducir a la muerte del embrión.
DAÑO DEL ADN E ICSI
El daño del ADN espermático, valorado mediante TUNEL, se relaciona inversamente con la tasa de fertilización en la ICSI11. En pacientes con un alto daño del ADN espermático (> 25%), la fertilización fue > 20%.
La proporción de espermatozoides con fragmentación del ADN influye en la tasa de fecundación e implantación de los embriones obtenidos mediante ICSI y la sitúa cerca del 10%. No se originó ningún embarazo si había más de un 20% de espermatozoides recuperados positivos para TUNEL, lo que sugiere que el daño del ADN puede tener un buen valor predictivo en los casos de fallo recidivante en la implantación de embriones de buena calidad26.
El índice de fragmentación del ADN (DFI) se correlacionó inversamente con la fecundación (r = 0,70; p = 0,03) y la calidad embrionaria (r = 0,70; p = 0,03) tras la realización de FIV e ICSI. El porcentaje de DFI era inferior en los varones infértiles que lograron un embarazo clínico después de una técnica de reproducción asistida21,13,25 que en los que no hubo embarazo (p = 0,001)27.
Mediante la técnica SCSA se puede predecir la falta de embarazo cuando los esperamatozoides recuperados muestran un desnaturalización del ADN ácido-inducido >= 27% de DFI28.
Sin embargo, en algunos estudios no se ha observado el efecto negativo de los espermatozoides con ADN defectuoso en la fecundación y el embarazo25,29,30. Hammadeh et al31 no encontraron diferencias significativas en los índices de fertilización, implantación y embarazo en pacientes a los que se les realizaba ICSI con diferentes grados de descondensación nuclear espermática31,32.
Recientemente se ha publicado que el grado de fragmentación del ADN espermático y su estabilidad pueden predecir el éxito en el recurso a inseminaciones artificiales intrauterinas21. Los autores refirieron que el grado de fragmentación del ADN después de la preparación espermática era significativamente inferior en las muestras que obtuvieron el embarazo en relación con las que no lo lograron. No se consiguieron embarazos en las pacientes en las que se utilizaron muestras con > 12% de los espermatozoides con el ADN fragmentado.
MÉTODOS PARA MEDIR LAS LESIONES EN EL ADN
En la actualidad se dispone de distintas técnicas que permiten detectar la presencia de lesiones en el ADN33. A continuación se resumen sus bases metodológicas y algunas de las correlaciones de los resultados de las distintas técnicas con la distintos parámetros de infertilidad en el varón.
Ensayo TUNEL
El ensayo TUNEL (Terminal deoxinucleotidyl transferase-mediated deoxyUridine triphosphate-Nick End Labeling) es uno de los más utilizados para medir las anomalías del ADN. En varios estudios se ha demostrado una correlación inversa entre el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado y la movilidad, la concentración y la morfología del eyaculado. En diversos estudios que han utilizado este ensayo TUNEL se ha abordado su utilidad como predictor del éxito en las técnicas de reproducción asistida21,34,35.
El ensayo TUNEL se basa en el principio de que la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) incorpora dUTP en roturas de cadenas dobles o simples del ADN. En concreto, en el ensayo se incorpora desoxiuridina biotinilada al 3'OH del ADN. La biotina actúa como señal y puede ser detectada fácilmente, por ejemplo, a través de técnicas fluorescentes. Cuantas más roturas tenga el ADN mayor será la señal resultante. En los espermatozoides con ADN normal sólo se detecta fluorescencia de fondo, mientras que los espermatozoides con ADN fragmentado (múltiples 3'-OH terminales) se tiñen con una fluorescencia intensa36. La fluorescencia puede detectarse tanto por citometría de flujo como a través de microcopia fluorescente37.
ANALISIS DE LA ESTRUCTURA CROMATINICA DEL ESPERMATOZOIDE (SCSA)
La técnica SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) se basa en el principio de que la cromatina anormal presenta una mayor susceptibilidadin situ a desnaturalizarse parcialmente. El grado de desnaturalización resultante como consecuencia de su tratamiento mediante calor o con ácido se determina midiendo el cambio metacromático del colorante naranja de acridina (acridine orange [AO]) de fluorescencia verde (AO intercalado) a una fluorescencia roja (AO sin intercalar)38. Los resultados se expresan como el índice de fragmentación de ADN (DFI). Dado que los resultados del SCSA son más constantes en períodos prolongados que los parámetros de la OMS, esta técnica resulta apropiada en estudios epidemiológicos de la esterilidad masculina39. El SCSA se ha usado para predecir la capacidad de fertilización, implantación y embarazo tras las técnicas de reproducción asistida (TRA)40. Los resultados de SCSA también se han correlacionado con la fertilidad in vivo41.
Ensayo comet
El ensayo comet, también conocido como electroforesis de células únicas para el análisis del ADN de una sola célula, fue introducido por primera vez por Ostling y Johanson en 198442 y fue modificado posteriormente en 198843. Cuando se descondensa el ADN del espermatozoide en el seno de un gel y se somete a la acción de un campo eléctrico, las moléculas de ADN se desplazan y generan una imagen en forma de cometa (de ahí el nombre de ensayo comet). La presencia de daño en el ADN se cuantifica midiendo la longitud de la cola. A su vez pueden utilizarse también otros parámetros de medida, tales como el "momento de la cola", que es el producto de la longitud de la cola por su intensidad (fracción del total del ADN de la cola)44.
El ensayo comet ha sido usado de forma satisfactoria en la evaluación de la presencia de daño en el ADN tras la criopreservación de los espermatozoides45. También se ha descrito que puede predecir el porcentaje de desarrollo embrionario tras FIV e ICSI, especialmente en parejas con esterilidad de causa desconocida22,46.
Ensayo in situ Nick Translation
El análisis de in situ Nick Translation (NT) cuantifica la incorporación dUTP (desoxiuridin trifosfato) biotinilado a las roturas del ADN de cadena sencilla en una reacción catalizada por la polimerasa I. El ensayo NT detecta los espermatozoides que contienen valores apreciables de daño endógeno en su ADN. Los resultados del análisis de NT indican la presencia de anomalías originadas durante la remodelación de la cromatina del espermatozoide.
El estudio de la integridad nuclear espermática mediante el análisis NT evidencia una buena correlación con la movilidad y la morfología espermática, y en menor medida con la concentración de espermatozoides en el semen5,9. Los resultados del análisis de NT muestran una correlación muy buena con la sensibilidad de CMA3 y el análisis TUNEL (r = 0,86; p = < 0,05 y r = 0,87; p = < 0,05, respectivamente). También se ha utilizado el análisis de NT para demostrar la presencia de daño en el ADN debido a la presencia de radicales libres originados por la presencia de leucocitos en el tracto reproductor masculino48.
Test de naranja de acridina
El ensayo naranja de acridina mide la susceptibilidad del ADN del espermatozoide al ácido inducido por la desnaturalización in situ por cuantificación del cambio metacromático del naranja de acridina fluorescente del verde (ADN natural) al rojo (ADN desnaturalizado). El naranja de acridina fluorescente se intercala entre las dobles cadenas de ADN como un monómetro y liga las cadenas simples del ADN como un agregado. El naranja de acridina monométrico vira al ADN natural o verde fluorescente mientras que el naranja de acridina agregado al ADN desnaturalizado vira a rojo fluorescente49. El naranja de acridina puede usarse tanto con el microscopio de fluorescencia como con citometría de flujo.
Tinciones con naranja de acridina muestran una diferencia significativa entre los varones fértiles y aquellos que son infértiles por diferentes patologías andrológicas. El valor de corte entre varones fértiles e infértiles varia entre el 20 y el 50%18,50,51.
SIGNIFICACIÓN CLÍNICA DEL DAÑO DEL ADN ESPERMÁTICO
Los parámetros seminales convencionales no son útiles en los pacientes con esterilidad idiopática. Tampoco en las técnicas de reproducción asistida estos parámetros seminales clásicos tienen mayor importancia. Las técnicas de reproducción asistida suponen un salto en los mecanismos de selección espermática natural y permiten incrementar las posibilidades de que un espermatozoide pueda fertilizar un oocito52 con material genómico alterado. Las circunstancias cambiantes obligan al desarrollo de procedimientos alternativos que permitan evaluar la calidad espermática, tales como el estudio del daño del ADN espermático, procedimiento que adquiere una mayor relevancia y del que en la actualidad disponemos ya de numerosa información que lo relaciona con las técnicas de reproducción asistida y con el embarazo natural. La mayoría de los estudios muestran una significativa correlación inversa del daño del ADN espermático y el índice de fertilidad.
En algunas publicaciones se no ha encontrado una relación entre el daño del ADN espermático y el índice de fertilidad, ya que se sugiere que el ICSI evita los mecanismos naturales de selección espermática, lo que permite que espermatozoides con alteraciones del ADN puedan fertilizar oocitos. Sin embargo, la mayoría de estos estudios refiere una relación entre el deterioro del ADN espermático y los índices de embarazo, lo que pone de manifiesto que el embrión emplea determinados mecanismos con fin de prevenir la posible transmisión de anomalías en el material genómico. La aparente disparidad en algunas observaciones puede ser explicada por la variedad de las técnicas empleadas en la medición del daño del ADN espermático, así como por el recurso a técnicas de reproducción asistida en pacientes con diversas etiologías y no sólo en los afectados de un factor masculino.
Cuando un espermatozoide con un severo daño en su ADN fertiliza un oocito, el embrión puede alterarse en su desarrollo o implantarse en el útero y provocar un aborto espontáneo en un estadio más tardío. De igual manera, cuando un espermatozoide con un mínimo daño en su ADN es utilizado, el desarrollo fetal puede verse afectado más tardíamente y puede dar lugar a un niño con anomalías congénitas.
En conclusión, en la actualidad se dispone de bibliografía en la que se evidencia que el daño espermático puede influir en la fertilidad de las parejas, incluso si el espermatozoide con alteraciones del ADN fertiliza un óvulo y origina un nacimiento, ya que es posible que se produzca una anomalía congénita. Por tanto, es prudente controlar el daño del ADN en los pacientes estériles y se debe protocolarizar de manera sistemática el estudio cromosómico del daño del ADN en los laboratorios clínicos. Los resultados del daño del ADN pueden ayudar al clínico en la evaluación y mejor consejo de las parejas estériles en relación con sus posibilidades de lograr una gestación a término y obtener un niño sin alteraciones.