Potencial genotóxico del extracto oleoso de la semilla de Carapa guianensis Aublet para inducir anomalías en la morfología de la cabeza del espermatozoide

Resumen

Objetivo

La presente investigación se realizó con el objetivo de evaluar el potencial genotóxico del extracto oleoso de la semilla de Carapa guianensis para inducir anomalías en la morfología de la cabeza del espermatozoide en ratones machos Balb/c.

Materiales y métodos

Se formaron 5 grupos experimentales: un grupo placebo (Tween 65 al 2%), 3 niveles de dosis del extracto (400, 1.000 y 2.000 mg/kg), administrados por vía oral durante 35 días, y por último un grupo control positivo tratado con ciclofosfamida (CF), en dosis de 50 mg/kg por vía intraperitoneal durante 5 días y 35 días de reposo después de la última administración con el mutágeno. Se distribuyeron 8 animales/grupo. Después de los 35 días de administración se eutanizaron por dislocación cervical y se extrajeron ambos epidídimos para ser procesados y evaluados según esta técnica citogenética.

Resultados y discusión

Los resultados obtenidos entre controles y tratados con el extracto no difirieron en cuanto a la frecuencia de las diferentes anomalías de la cabeza del espermatozoide encontradas, y tampoco en la concentración espermática y de espermatozoides con gota citoplasmática. Sin embargo, sí difirieron controles y tratados contra el grupo tratado con CF, validando nuestros resultados. Se concluye que el extracto oleoso de la semilla de Carapa guianensis no posee potencialidades genotóxicas para inducir aumento en la frecuencia espontánea de la morfología de la cabeza del espermatozoide de ratones machos Balb/c.

Abstract

Objective

This study has aimed to evaluate the genotoxic potential of Carapa guianensis seed oil extract to induce sperm head abnormalities in Balb/c mice.

Material and methods

Five experimental groups were formed: one placebo group (Tween 65, 2%), three extract dose levels (400, 1000 and 2000 mg/kg) administered orally for 35 days and one positive control group treated with cyclophosphamide (CP) at a dose of 50 mg/kg via intraperitoneally for 5 consecutive days and then 35 days of rest after the last administration with the mutagen. Were distributed 8 animals per group. The animals were euthanized by cervical dislocation 35 days after the administration and the epididymis was extracted to proceed with the sperm head morphology assay.

Results and discussion

There were no significant differences in the results between the controls and those treated with the extract regarding frequency of the different sperm head anomalies or in the spermatic concentration and sperms with cytoplasmic drop. However, a difference was found between the controls and treated versus the CP treated group, validating our results. We have concluded that the oleaginous extract of Carapa guianensis seeds does not have genotoxic potentialities to induce an increase in the spontaneous frequency in the sperm head morphology of male Balb/c mice.

Introducción

Carapa guianensis pertenece a la familia Meliaceae. Es una planta medicinal muy popular en varios países del mundo, y en Cuba es conocida como cedro macho.

La caracterización del aceite de la semilla de Carapa guianensis ha revelado la presencia de ácidos grasos merístico, palmítico, oleico, linoleico^1,2, esteárico y ácido araquidónico³. Algunos tetraterpenoides también han sido aislados de la semilla de Carapa guianensis³.

También se ha observado que los tetraterpenoides obtenidos de la semilla de Carapa guianensis tienen una significativa actividad antialérgica, debida a la inhibición del factor nuclear kB y la supresión de la IL-5 y el CCL11/eotaxina⁴.

Recientemente se han descrito el potencial antioxidante y la capacidad como protector solar e insecticida del extracto oleoso de Carapa guianensis^5-9. Esta planta abunda en el Caribe, especialmente en Belice, Trinidad y Tobago y Cuba^6,8,9. Los estudios fitoquímicos de los extractos obtenidos en estas regiones denotan la presencia mayoritaria de ácidos grasos poliinsaturados y de compuestos fenólicos tales como taninos y limonoides.

Una vez que ha sido demostrado su efecto antioxidante mediante la administración oral del extracto durante 3 semanas en ratas Sprague Dawley de ambos sexos, co-administradas con una sustancia oxidante donde se demostró su efecto protector a la formación de especies reactivas del oxígeno⁹, se hace necesaria la evaluación de su nivel de seguridad, al menos en los ensayos de toxicidad clásica de primera y segunda barrera¹⁰.

Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo de esta investigación fue evaluar el potencial genotóxico del extracto oleoso de la semilla de Carapa guianensis para inducir anomalías en la morfología de la cabeza del espermatozoide de ratones machos de la línea Balb/c.

Fue utilizada la línea Balb/c basándonos en los resultados de nuestras investigaciones, ya que al ser comparada esta línea con otras en este ensayo resultó ser el mejor biomodelo, experimentando baja frecuencia de anomalías en la cabeza del espermatozoide, alta concentración espermática y respuesta aceptable a clastógenos químicos como la ciclofosfamida (CF)¹¹.

Además existen investigaciones que demuestran que el extracto oleoso obtenido de la semilla de Carapa guianensis provoca problemas de infertilidad en dosis repetidas, aunque no han sido investigadas para demostrar su relación directa con la fertilidad del macho¹².

Materiales y métodos

Animales

Se utilizaron ratones Balb/c de ambos sexos adultos jóvenes (5-7 semanas), procedentes del Centro de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, Cuba), cuyo peso corporal oscilaba entre 25-30 g al término de la cuarentena (7 días), durante la cual los animales se adaptaron a las condiciones del laboratorio. La temperatura se mantuvo en 24 ± 2 °C, la humedad entre 55 ± 10% y los ciclos de luz-oscuridad fueron de 12 h. El alimento administrado a los animales durante toda la experiencia fue pienso estándar para esta especie preparado en el CENPALAB. El acceso al agua y al alimento fue ad líbitum.

Obtención del extracto oleoso

Se agregó N-hexano a razón de 2 kg de semilla de Carapa guianensis previamente secado y triturado. Se dejó en reposo durante 60 min y luego se filtró al vacío. El solvente se adicionó hasta que la muestra botánica del aceite se saturó y luego fue removido reduciendo presión. El rendimiento del extracto fue del 29% (v/w). Se calculó la densidad aparente del aceite (0,81 g/ml), y este resultado fue utilizado para definir el volumen exacto que cada animal recibió. El aceite fue conservado a –20 °C hasta su uso.

Administración y dosificación

El extracto oleoso se suspendió en Tween 65 (2%) 2 h antes de la administración, y las concentraciones se ajustaron semanalmente en función del aumento del peso corporal. Se propuso emplear la vía oral por ser la que coincide con la propuesta en la terapéutica.

Los animales se distribuyeron aleatoriamente (8 ratones/grupo) en 5 grupos experimentales: un grupo control de vehículo (Tween 65 al 2%), 3 tratados con el extracto oleoso de Carapa guianensis (400, 1.000 y 2.000 mg/kg) y un control positivo tratado con CF (N,N-bis [cloruro de etilo]-N’, O-esterdiamida del ácido fosfórico propinel). Las emulsiones realizadas con el extracto y vehículo se administraron mediante intubación gástrica (2 ml/kg) durante 35 días, en el horario comprendido de 10:00 a 11:00 a.m. La CF se administró 5 días consecutivos (50 mg/kg) por vía intraperitoneal en el horario de 10:00 a 11:00 a.m. y luego estuvieron 35 días sin administrar, según se establece para este ensayo¹³.

La dosis menor del extracto ha sido empleada en estudios farmacológicos preclínicos^3,6,14,15 y ha demostrado ser efectiva en los modelos contra Leishmania, cáncer de útero y como antioxidante, y 2 niveles superiores múltiplos de este (1.000 y 2.000 mg/kg)^14,15.

Observaciones clínicas

Se realizaron 2 observaciones clínicas diarias, en el horario comprendido entre las 8:30-10:30 a.m. y en el horario de la tarde de 3:00-4:30 p.m. Durante cada observación se tuvo en cuenta el estado clínico general del animal, lo cual incluyó la palpación para la detección de lesiones y de posibles afectaciones respiratorias, del sistema nervioso, cardiovascular, gastrointestinal, estado de la piel, pelo, coloración de las mucosas y ojos.

Ensayo de la morfología de la cabeza del espermatozoide

Este ensayo se realizó de acuerdo a las normas de la ICH de 2005 sobre toxicología de la fertilidad del macho^13,16. Para realizar este ensayo se procedió a extraer ambos epidídimos, los cuales se redujeron a pequeños fragmentos, siendo depositados en placas de Petri que contenían 3 ml de solución isotónica de NaCl al 0,9%¹³. La muestra se homogenizó con pipetas Pasteur¹³.

Recuento de espermatozoides

El contenido de la placa se colocó en un tubo graduado, al cual se le añadieron 0,05 ml de tripsina al 0,25%, y transcurridos 5 min de tripsinización se le añadieron 2 ml más de NaCl al 0,9%. Luego se realizó una dilución del homogeneizado tripsinizado en NaCl-formol al 1% (1:10) y se colocó en una cámara de Neubauer, conectándose ambos lados de la cámara al microscopio Olympus BH-2 a 10×^13,16,17.

Morfología del espermatozoide

Al tubo que contenía la dilución del homogeneizado ya diluido se le añadieron 5 gotas de eosina al 1%, dejándolo reposar durante 5 min. Posteriormente se extendió una gota sobre una lámina seca y se colocó el cubreobjeto^13,16,17. Se prepararon 2 láminas por animal y se analizaron 500 espermatozoides con la ayuda de un microscopio Olympus BH-2 a 40×. Las observaciones fueron realizadas «a ciegas» por 2 observadores independientes para luego establecer un promedio entre ambos. El criterio de clasificación se basó en cabezas normales y anormales, que incluyen amorfas, banana, sin gancho y con 2 colas^13,16,17. Además se determinó el porcentaje de espermatozoides con gota citoplasmática (EGC) como índice de fertilidad, inmadurez celular y citotoxicidad¹⁸.

Eutanasia

A todos los animales se les practicó la eutanasia por dislocación cervical teniendo en cuenta el tiempo de exposición a cada una de las sustancias evaluadas¹⁹.

Procedimientos éticos

Este trabajo fue confeccionado sobre la base de buenas prácticas de laboratorio preclínico presentes en el reglamento nacional de aprobación de protocolos de investigación de la República de Cuba. Además, al comenzar esta investigación se obtuvo por escrito el consentimiento de aprobación del protocolo e informe por el comité institucional de ética para la experimentación animal de nuestras instituciones.

Análisis estadístico

Se procedió a verificar los supuestos para realizar el análisis de varianza. Los resultados obtenidos están distribuidos normalmente (normalidad, según el test de Kolmogorov-Smirnov), existe dependencia entre las observaciones y presentan homogeneidad de varianzas (prueba de Levene)¹³. Por ello, todos los resultados se analizaron mediante el método de análisis de varianza (ANOVA)^13,17. El nivel de significación establecido fue α = 0,05. Todos los análisis se realizaron empleando el paquete estadístico Statsoft for Windows, StatSoft, Inc. (2003), STATISTICA (data analysis software system), versión 6.

Resultados

No hubo muertes durante el estudio ni se detectaron signos clínicos de toxicidad. No hubo diferencias significativas entre grupos tratados y controles en las variables que miden las diferentes anomalías en la cabeza del espermatozoide (variables genotóxicas); sin embargo, en el componente que mide citotoxicidad sí hubo diferencias entre el grupo control negativo y la dosis máxima administrada (2.000 mg/kg) (tabla 1). El porcentaje de EGC se comportó de forma similar entre controles y tratados, sin diferencias significativas entre los promedios de estos.

Tabla 1.

Efecto del extracto oleoso de la semilla de Carapa guianensis en la morfología de la cabeza del espermatozoide en ratones machos Balb/c

Grupo	Normales	Anormales	Amorfos	Bananas	Sin gancho	Dos colas	% EGC	Concentración^* (10^6 células/ml)
CN	488,98 ± 4,36^a	11,02 ± 4,36^a	7,11 ± 6,03^a	1,42 ± 1,00^a	2,09 ± 2,01^a	0,40 ± 1,26^a	3,68 ± 1,57^a	2,31 ± 0,25^a
CF	399,93 ± 10,28^*	100,07 ± 4,40^*	36,08 ± 8,21^*	24,77 ± 2,66^*	31,23 ± 4,37^*	7,99 ± 1,86^*	25,48 ± 6,84^*	0,82 ± 0,16^*
ECG 400 mg/kg	488,31 ± 3,81^a	11,69 ± 3,81^a	8,33 ± 3,88^a	1,00 ± 0,94^a	2,00 ± 1,93^a	0,36 ± 1,04^a	3,99 ± 1,11^a	2,10 ± 0,20^a
ECG 1.000 mg/kg	486,12 ± 5,72^a	13,88 ± 2,72^a	9,57 ± 4,10^a	1,63 ± 1,21^a	2,20 ± 2,12^a	0,48 ± 1,33^a	3,81 ± 1,49^a	1,88 ± 0,29^a
ECG 2.000 mg/kg	485,81 ± 2,90^a	14,19 ± 2,90^a	9,89 ± 5,21^a	1,70 ± 1,27^a	2,06 ± 2,05^a	0,54 ± 1,20^a	3,71 ± 1,05^a	1,41 ± 0,21^*^,^a

Determinaciones en 500 células/animal.

CF: control positivo, ciclofosfamida 50 mg/kg por vía i.p. durante 5 días consecutivos; CN: control negativo; ECG: extracto oleoso de Carapa guianensis (administración por vía oral durante 35 días); EGC: espermatozoides con gota citoplasmática.

a

Difiere contra el control positivo (CF) con el mismo análisis estadístico (X: media; DE: desviación estándar).

*

p < 0,05 (comparación con el control negativo, ANOVA).

En los grupos tratados con el extracto el promedio de espermatozoides anómalos de tipo amorfo fue entre 8,33 y 9,89, y para el caso de los de tipo banana estuvo entre 1,00 y 1,70. Los espermatozoides sin gancho se presentaron en una frecuencia entre 2,00 y 2,20 como promedio en 500 células registrables, y los que tenían 2 colas se presentaron como promedio entre 0,36 y 0,54. El porcentajeo de EGC estuvo entre 3,71 y 3,99, y la concentración de espermatozoides en el epidídimo experimentó resultados entre 1,41 y 2,10 × 10⁶ células/ml.

El grupo tratado con CF como control positivo sí experimentó diferencias significativas con los controles y tratados con el extracto en todas las variables medidas en este ensayo, tanto en las variables que miden daño genotóxico como las que miden daño citotóxico.

Discusión

Los resultados que se aprecian en la tabla 1 demuestran que el tratamiento con el extracto oleoso de la semilla de Carapa guianensis por vía oral durante 35 días en ratones Balb/c machos mantuvo los índices espontáneos del número de anomalías en la morfología de la cabeza del espermatozoide. De igual forma, no interfirió en la división celular, aunque la dosis máxima evaluada difirió con el control negativo y con el control positivo, con resultados intermedios en la concentración espermática.

Resultados similares obtuvieron Costa et al.¹² cuando evaluaron el extracto oleoso de esta planta en estudios toxicológicos reproductivos, donde hubo una ligera disminución de la fertilidad en ratas Wistar en la dosis máxima, sin diferir con los controles.

Los resultados obtenidos en la morfología de la cabeza del espermatozoide en los animales tratados con las diferentes dosis del extracto coinciden sin diferir con los reportados para esta especie y línea en particular¹¹.

Además, la concentración espermática obtenida en los grupos tratados con el extracto en las dosis de 400 y 1.000 tampoco difirió con los datos basales reportados para esta especie y línea¹¹. Los resultados de la concentración espermática en el grupo de 2.000 mg/kg, además de diferir con el grupo control negativo y positivo, también difirió con los datos espontáneos de citotoxicidad reportados para esta línea de ratón¹¹.

El hecho de que se hayan reportado diferencias entre los tratados con el extracto y controles negativos contra el grupo tratado con CF valida la conducción de nuestro ensayo, dando mayor confiabilidad a nuestros resultados. Además, estos resultados son consistentes con los reportados para la CF en esta especie y línea, utilizando inclusive otros esquemas de tratamiento^11,20,21.

El D-004, un extracto con similar composición en ácidos grasos, tampoco modificó la concentración espermática ni la frecuencia en las morfoanomalías de la cabeza del espermatozoide en ratones OF-1 tratados por vía oral con dosis máximas del extracto oleoso de Roystonea regia de 1.500 mg/kg²². Además, estos resultados fueron consistentes al evaluarse en ratas SD en dosis de 2.000 mg/kg utilizando este mismo ensayo²³.

Los resultados de genotoxicidad obtenidos en este ensayo concuerdan con los reportados en el ensayo de micronúcleos en este mismo extracto, donde dosis de 2.000 mg/kg no modificaron la formación espontánea de micronúcleos en eritrocitos de médula ósea²⁴, sin clasificar como genotóxico este ensayo ni el biomodelo utilizado²⁴. Sin embargo, hubo una disminución, aunque no significativa, al compararse con los controles en el indicador eritrocitos policromáticos/eritrocitos normocromáticos, índice que mide el componente citotóxico de este ensayo en los ratones macho²⁴.

El porcentaje de EGC no se modificó, y se demostró que tiene un gran componente oxidativo como indicador de fertilidad por la formación de especies reactivas del oxígeno. Este hallazgo morfológico está relacionado directamente con la aparición de infertilidad, inmadurez celular y citotoxicidad. El hecho de que el extracto no haya aumentado y además haya mantenido la frecuencia espontánea de aparición de EGC en la línea de ratón utilizada concuerda con las propiedades antioxidantes ya reportadas con anterioridad, al ser rico en ácidos grasos y terpenoides⁹.

Es importante comentar que la ausencia de efecto mutagénico y citotóxico del extracto oleoso de Carapa guianensis observado en este estudio no se relaciona con una inadecuada exposición a la sustancia ensayo, ya que las dosis por vía oral de este producto entre 100 y 350 mg/kg, inferiores a las utilizadas en el presente estudio, han producido efectos farmacológicos importantes^3-6,9,12.

En conclusión, la administración por vía oral de dosis repetidas del extracto oleoso de la semilla de Carapa guianensis (400, 1.000 y 2.000 mg/kg) durante 35 días no posee potencialidades genotóxicas para inducir aumento en la frecuencia espontánea de la morfología de la cabeza del espermatozoide de ratones machos Balb/c.

Responsabilidades éticas

Derecho a la privacidad y consentimiento informado

Los autores han obtenido el consentimiento informado de los pacientes y/o sujetos referidos en el artículo. Este documento obra en poder del autor de correspondencia.

Confidencialidad de los datos

Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.

Protección de personas y animales

Los autores declaran que los procedimientos seguidos se conformaron a las normas éticas del comité de experimentación humana responsable y de acuerdo con la Asociación Médica Mundial y la Declaración de Helsinki.

Financiación

Esta investigación obtuvo financiación del Instituto Finlay y del Instituto de Farmacia y Alimentos de la Universidad de La Habana.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.