Las infecciones respiratorias agudas (IRA) son una de las principales causas de consultas médicas y de hospitalización en niños, ancianos y en pacientes inmunocomprometidos, con mayor frecuencia durante el otoño e invierno1,10. La mayoría de estas infecciones son causadas por virus respiratorios, que pueden ser detectados por métodos clásicos, como el cultivo o la identificación de antígenos virales por inmunofluorescencia (IF); por pruebas rápidas de inmunocromatografía o por métodos moleculares que amplifican el genoma viral, como la PCR.

Tanto en Argentina como en muchos países latinoamericanos, los programas nacionales de vigilancia epidemiológica se basan en técnicas de IF. Este método ha sido el de elección por su bajo costo, su capacidad para procesar un gran número de muestras simultáneamente y su simplicidad. Sin embargo, requiere un operador entrenado, un microscopio de fluorescencia de calidad y el uso de controles adecuados. Aunque es bien sabido que los métodos moleculares son más sensibles que la IF, no han sido aún ampliamente incorporados debido al mayor costo de los reactivos y del equipamiento, y al tiempo requerido para la extracción, amplificación y detección del genoma viral. Sin embargo, a partir de la pandemia de influenza en 2009, la implementación de métodos moleculares ha aumentado significativamente, incluyendo las RT-PCR para influenza y los rinovirus en el diagnóstico de rutina.

En la actualidad, existe una variedad de ensayos comerciales de PCR múltiples que permiten la detección de los virus respiratorios, con una alta sensibilidad y especificidad12. Uno de ellos es el panel respiratorio (PR) FilmArray (FilmArray Respiratory Panel [BioFire Diagnostics, UT, EE. UU.]) (PR-FilmArray), que ha sido aprobado recientemente (2012) por la FDA. Este es un equipo automatizado que utiliza un cartucho plástico con diferentes compartimentos que incluyen todos los reactivos para realizar la extracción de los ácidos nucleicos y PCR múltiples. El PR-FilmArray permite la detección de 17 virus respiratorios y 3 patógenos bacterianos, y requiere 5min de procesamiento manual y 65min de tiempo de instrumentación13.

El objetivo de este estudio fue comparar el desempeño de los métodos habitualmente utilizados en nuestro laboratorio (IF y RT-PCR) con el PR-FilmArray para el diagnóstico viral de las IRA en niños. Asimismo, se analizó la capacidad del ensayo comercial para detectar otros patógenos respiratorios que generalmente no son incluidos en el diagnóstico de rutina de las IRA en Argentina.

Se realizó un estudio retrospectivo en 315 muestras respiratorias congeladas a −70°C para evaluar el PR-FilmArray y compararlo con los métodos utilizados en nuestro laboratorio (IF y RT-PCR).

De las 315 muestras respiratorias de niños con IRA estudiadas, 235 (74,6%) fueron positivas con los ensayos utilizados en nuestro laboratorio (IF para 8 virus y RT-PCR para HRV). Cuando las mismas muestras se estudiaron con el PR-FilmArray (para 17 virus y 3 bacterias), la frecuencia de positividad aumentó al 96,8% (305/315). Sin embargo, si consideramos solo los 9 virus respiratorios que detectan ambos métodos (RSV, AdV, FluA, FluB, PIV 1-3, HMPV, HRV), el PR-FilmArray permitió un diagnóstico positivo en el 92,1% (290/315) de las muestras.

El porcentaje de acuerdo positivo (sensibilidad) de nuestros métodos con el PR-FilmArray varió desde el 41,9% hasta el 91,7% dependiendo del virus (tabla 1). Sin embargo, solo para 2 virus, HMPV y HRV, el porcentaje superó el 80%. Los virus con el acuerdo positivo más bajo fueron PIV 1-3 (41,9%) y AdV (50,0%).

El porcentaje de acuerdo negativo (especificidad) fue alto para todos los virus respiratorios, y varió entre el 98,6% y el 100%.

Al comparar los diagnósticos obtenidos por nuestros ensayos con los del PR-FilmArray, se observaron resultados significativamente discordantes entre ambas metodologías para todos los virus, excepto para HMPV. La diferencia entre ambas metodologías fue más evidente en los niños ambulatorios que en los internados (tabla 2). En estos últimos, las frecuencias de positividad obtenidas con nuestros ensayos y con el PR-FilmArray fueron del 89,5% y del 99,2%, respectivamente, mientras que en ambulatorios estas fueron del 63,7% y del 95,1%, respectivamente.

El PR-FilmArray detectó patógenos respiratorios que no son estudiados por nuestros ensayos de rutina (tabla 2). Se observó una alta frecuencia de HBoV, presente en el 18,4% de los niños estudiados. Se detectaron las 4 especies de HCoV (10,5%): 12 HCoV-OC43, 12 HCoV-HKU1, 7 HCoV-NL63 y 2 HCoV-229E. La mayoría se encontraron en infección múltiple, excepto 3 de ellos detectados como agentes únicos. El PIV 4 se detectó en 6 (1,9%) pacientes, en 3 como agente único y en los otros 3 en coinfecciones con HRV y HBoV. Respecto a las bacterias, se detectaron 2 C. pneumoniae y una B. pertussis, ambas en coinfección con algún virus respiratorio, en muestras de niños internados. No se detectó ningún M. pneumoniae.

Con los métodos empleados en nuestro laboratorio se detectaron coinfecciones virales en 30 de 235 (13%) pacientes con diagnóstico positivo; estas fueron significativamente más frecuentes en niños internados que en ambulatorios. La coinfección HRV-RSV fue la más frecuente (n=8), seguida por HRV-AdV (n=6) y HRV-PIV (n=5) (tabla 2).

Cuando las muestras se estudiaron con el PR-FilmArray, el número de coinfecciones múltiples fue mayor: 124 de 305 muestras positivas (40,7%). En detalle, 94 (75,8%) muestras fueron positivas para 2 patógenos, 24 (19,4%) fueron positivas para 3 virus, 5 (4%) fueron coinfecciones cuádruples y solo una muestra (0,8%) fue positiva para 5 patógenos. Las coinfecciones dobles más frecuentes fueron HRV-RSV (n=17), HRV-HBoV (n=11), RSV-HBoV (n=9) y HRV-PIV (n=7) (tabla 3). Las coinfecciones múltiples (triples, cuádruples y quíntuples) detectadas pueden observarse en detalle en la tabla 4.

En niños con IRA, el PR-FilmArray permitió un mayor diagnóstico de virus respiratorios (97%) que los métodos de rutina utilizados en nuestro laboratorio (75%). Esto no solamente ocurrió por la detección de virus y bacterias que no se investigan habitualmente, sino también por la mayor sensibilidad del PR-FilmArray en la detección de los virus que se pueden detectar por IF. Si consideramos solo los 8 virus respiratorios estudiados por IF y los HRV por RT-PCR, la frecuencia de positividad alcanzada por el PR-FilmArray fue del 92%.

Las frecuencias de positividad obtenidas en pacientes internados fueron significativamente mayores que en ambulatorios, tanto por nuestros métodos como con el PR-FilmArray. Esto podría deberse a una posible diferencia en la calidad de las muestras analizadas, las cuales variaron de acuerdo a la condición del paciente: aspirados nasofaríngeos en internados e hisopados nasofaríngeos con hisopos flexibles en ambulatorios. Sin embargo, numerosas publicaciones describen que los hisopos flexibles permiten obtener muestras de calidad similar a los aspirados nasofaríngeos2,4.

Debido a que no existe aún un método patrón para la detección de todos los virus respiratorios, cuando comparamos los resultados obtenidos por nuestros procedimientos habituales con el PR-FilmArray empleamos el término «acuerdo positivo» en lugar de sensibilidad, y «acuerdo negativo» por especificidad. El acuerdo positivo obtenido fue muy variable dependiendo del virus estudiado: fue alto para HMPV y HRV, aceptable para RSV y Flu, pero muy bajo para AdV y PIV. Si consideramos el acuerdo negativo observado, este fue muy alto para todos los virus estudiados, del 98-100%. Como era esperable, sobre todo para virus de baja frecuencia, existe una mayor posibilidad de que ambas metodologías coincidan en el diagnóstico de las muestras negativas. Analizando todos los datos en conjunto, pudimos determinar que solamente la IF para HMPV mostró resultados significativamente concordantes con el PR-FilmArray, mientras que para el resto, los resultados fueron significativamente discordantes, lo que implica que usando IF, como es bien sabido, se pierde un elevado número de diagnósticos positivos.

Poritz et al.13 compararon el PR-FilmArray con la IF directa y observaron un amplio rango de acuerdo positivo: para la mayoría de los virus este fue superior al 90%.

En relación con la detección de los HRV, nuestra RT-PCR detectó 115 casos, mientras que el PR-FilmArray detectó 137. Es importante destacar que el PR-FilmArray utiliza una combinación de PCR que detectan HRV y HEV, sin capacidad de distinguir entre ambos virus. Nuestra RT-PCR, que utiliza primers y una sonda adaptados del protocolo del CDC, tiene una mayor especificidad para HRV, aunque puede detectar algún enterovirus si estuviera presente en títulos muy altos9. Por ello, es posible que el PR-FilmArray sea más sensible que nuestra RT-PCR para algunos genotipos de HRV, pero también es probable que algunas muestras negativas por nuestra RT-PCR y positivas por el PR-FilmArray hayan sido HEV y no HRV11.

El PR-FilmArray permitió detectar por primera vez en nuestro medio los 4 HCoV causantes de infección respiratoria (NL63, 229E, OC43 y HKU1), con una frecuencia total del 10%. El trabajo realizado por Xu et al.17 detalla que en su población de estudio los diagnósticos positivos adicionales obtenidos con el PR-FilmArray fueron a expensas de la detección de los HRV y los HCoV, que no son incluidos en la detección por IF directa utilizada de rutina.

Los HBoV se detectaron con una frecuencia del 18% en ambas poblaciones de niños, internados y ambulatorios. Sin embargo, su papel como agente causal de IRA es aún controvertido, ya que se ignora su papel real como patógeno, por sí mismo o en coinfección con otros virus14.

Si bien se detectaron coinfecciones virales con nuestros métodos de rutina, su frecuencia aumentó 4 veces al utilizar el PR-FilmArray. Con este equipo se identificaron coinfecciones con 2, 3, 4 y hasta 5 virus respiratorios, y solo 3 bacterias se detectaron en coinfección. Para determinar si las coinfecciones se asocian con una mayor gravedad de los cuadros clínicos son necesarios nuevos estudios.

Una de las principales ventajas del PR-FilmArray es el corto tiempo de procesamiento manual (5min) y tan solo 1h de instrumentación hasta la obtención del resultado. Esto tiene un alto impacto clínico en el tratamiento de los pacientes, por ejemplo, en casos de B. pertussis en neonatos o en pacientes con Flu. Además, permite realizar el aislamiento de pacientes en cohortes y extremar medidas de higiene y prevención de la diseminación viral. Otra ventaja es su capacidad para detectar 20 patógenos respiratorios simultáneamente con una adecuada sensibilidad y especificidad. Esto fue probado por muchos investigadores que compararon el PR-FilmArray con otros métodos moleculares, ya sean convencionales o múltiples5,6,12. Además, es un sistema totalmente automatizado y cerrado, que disminuye notablemente la posibilidad de errores y contaminaciones comparado con otros ensayos de PCR. Las desventajas que presenta son su capacidad de procesar solo una muestra por corrida y el alto costo del equipo y de los reactivos.

La IF continúa siendo el método más utilizado en países de Latinoamérica, ya que es una técnica sencilla, de bajo costo, que permite procesar un número adecuado de muestras simultáneamente y obtener los resultados dentro de las 5h. Habitualmente se utiliza la IF para el diagnóstico de RSV, Flu, AdV y PIV 1-3, sin discriminar entre los 3 tipos de PIV y sin detectar el PIV 4. Es bien sabido, y en nuestro estudio lo confirmamos, que la sensibilidad de la IF para AdV es baja; por ello se sugiere el uso de un método molecular para obtener un diagnóstico de certeza3,15. Por el contrario, pudimos demostrar que la IF directa para HMPV presenta una elevada sensibilidad y especificidad, comparable a la de un método molecular como el PR-FilmArray.

Los HRV son los virus más frecuentemente detectados en niños con IRA, tanto en internados como en ambulatorios7,8,16. Sin embargo, dado que no existe una IF para detección directa de sus antígenos en muestras respiratorias, es imprescindible utilizar una técnica de RT-PCR para su diagnóstico.

En conclusión, con el presente estudio hemos confirmado que un método molecular como el que emplea el panel respiratorio FilmArray es más efectivo para realizar el diagnóstico de múltiples patógenos en pacientes con IRA. Sin embargo, por el momento, su costo hace difícil su incorporación en la rutina diaria. Por esta razón, la IF continúa siendo un método aceptable para el diagnóstico de los virus respiratorios más frecuentes.

Este trabajo fue financiado con el subsidio PICT 2006-650 otorgado a la Dra. Echavarria por la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCYT).

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

La Dra. D.N. Marcone es becaria posdoctoral y la Sra. C. Ricarte es personal técnico, ambas de CONICET; la Dra. G. Carballal es investigadora de CEMIC y la Dra. M. Echavarria es investigadora de CONICET y CEMIC.