Existen numerosas situaciones fisiopatológicas en la actividad clínica en las que el hígado se somete a una situación de isquemia transitoria, total o parcial (hepatectomías parciales, trasplante hepático, donantes en asistolia, estados de shock, situaciones de parada cardiorrespiratoria reversibles), pudiendo desarrollarse una lesión por la isquemia-reperfusión, que no se ha podido prevenir totalmente. Por tanto, es importante investigar, utilizando modelos experimentales, los mecanismos que están implicados en su producción, así como el efecto potencialmente beneficioso que puedan tener sobre la misma diferentes fármacos que interfieren sobre los mecanismos de producción, evitando la aparición posterior de la lesión, parcial o totalmente.
En este estudio revisamos, en primer lugar, los fundamentos patogénicos de las lesiones por isquemia-reperfusión, analizando los factores más importantes que se han implicado en la misma hasta la actualidad: calcio, endotelio, neutrófilos, activación del complemento, metales pesados, radicales libres de oxígeno y óxido nítrico.
En segundo lugar se revisa el papel beneficioso para prevenir las lesiones por isquemia-reperfusión de diversos antioxidantes (superóxido-dismutasa, alopurinol, vitamina E, captopril, propanolol y N-acetilcisteína).
Finalmente, se subrayan las perspectivas de futuro e implicaciones clínicas del estudio patogénico de la isquemia-reperfusión hepática, y cómo recientemente se ha implicado el fallo de los mecanismos enzimáticos reparadores del ADN, lesionado por los radicales libres, como polo de investigación para prevenir las lesiones por isquemia-reperfusión hepática.
In the clinical setting, there are a number of pathophysiological situations in which the liver is subjected to transient ischemia, whether total or partial (partial hepatectomy, liver transplantation, asystolic cardiac arrest in donors, shock, reversible cardiorespiratory arrest), that can lead to ischemia-reperfusion injury, complete prevention of which has yet to be achieved. Thus, it is necessary to employ experimental models to investigate the mechanisms implicated in its development, as well as the potentially beneficial effect of different drugs that interfere with the mechanisms responsible for its presentation, partially or totally preventing the resulting lesion.
First we review the pathogenic basis for ischemia-reperfusion injury, analyzing the major factors that have been implicated to date: calcium, endothelium, neutrophils, complement activation, heavy metals, oxygen free radicals and nitric oxide. Then we assess the beneficial role of certain antioxidants (superoxide dismutase, allopurinol, vitamin E, captopril, propranolol and N-acetylcysteine) in preventing the lesions associated with ischemia-reperfusion.
Finally, we discuss the future perspectives and clinical implications of the study of the pathogenesis of liver ischemia-reperfusion, pointing out the recent implication of the failure of the enzymatic mechanisms responsible for repairing DNA damage produced by free radicals as the focal point of research to prevent liver ischemia-reperfusion injury.
Introducción
Existen numerosas situaciones fisiopatológicas en la actividad clínica en las que la valoración de la función hepática es de gran importancia, y la corrección de sus alteraciones son fundamentales para la supervivencia del paciente. Esto sucede tanto en patología hepática, en relación con la cirugía (hepatectomías parciales, trasplante hepático, donantes en asistolia, etc.) como en enfermedades sistémicas, con repercusión hepática secundaria (estados de shock, situaciones de parada cardiorrespiratoria reversibles, conectivopatías con hipoperfusión de diferentes órganos, etc.1,2).
Además, cuando el hígado es sometido a una situación de isquemia transitoria, total o parcial, se sabe que desarrolla una lesión por la isquemia-reperfusión, que no se ha podido prevenir totalmente. Por tanto, es importante investigar los mecanismos que están implicados en su producción, así como el efecto potencialmente beneficioso que puedan tener sobre la misma diferentes fármacos que interfieren sobre los mecanismos de producción, evitando la aparición posterior de la lesión, parcial o totalmente.
Es necesario recurrir a un modelo experimental de isquemia-reperfusión en el que se puedan reproducir algunos de los fenómenos fisiopatológicos que suceden en diferentes situaciones de la clínica diaria. Y, de esta forma, poder valorar su aplicación clínica3-6.
En la isquemia-reperfusión se desarrollan una serie de fenómenos fisiopatológicos complejos en los que se implican todos los componentes celulares del parénquima hepático, así como del endotelio vascular7. Durante la isquemia, la hipoxia y otras situaciones de déficit energéticos, algunas proteasas citosólicas se activan por el aumento del calcio intracelular y catalizan la conversión de xantina deshidrogenasa (XD) a xantina oxidasa (XO). La xantina oxidasa, utilizando la hipoxantina por un lado y por otro el oxígeno molecular, aportado en la reperfusión, cataliza la formación del radical superóxido8. Los radicales libres formados, durante el período de reperfusión, atacan los enlaces insaturados de los ácidos grasos libres en la bicapa fosfolipídica de la membrana celular. Esta reacción, denominada lipoperoxidación, se propaga en cadena y provoca la fragmentación de la membrana celular y, con ello, severas alteraciones estructurales y funcionales de la membrana, finalizando en un daño celular irreversible. En esta reacción se generan aldehídos, que se utilizan como indicadores del grado de peroxidación9,10 (fig. 1).
El uso de antioxidantes y scavengers de radicales libres (superóxido-dismutasa, alopurinol, vitamina E, captopril, propanolol, etc.) podrá disminuir la reacción de lipoperoxidación y, con ello, la cadena patogénica de la isquemia-reperfusión, con un posible efecto beneficioso sobre la función hepática11.
En el hígado existe información contradictoria sobre la acción del óxido nítrico en las situaciones de estrés oxidativo. Se ha descrito su papel oxidante, pero también se conoce su capacidad generadora de potentes intermediarios oxidativos12,13.
El flujo sanguíneo de los pequeños vasos (microcirculación), durante la reperfusión tiene un papel central en el daño que aparece durante la reperfusión. La fluxometría mediante láser-Doppler se ha demostrado como un método útil para medir el flujo tisular hepático, demostrándose una relación entre la mayor duración de la isquemia, con un menor flujo y oxigenación tisular, durante la primera hora tras la reperfusión14.
Así pues, la isquemia-reperfusión va a generar una reacción de lipoperoxidación más o menos intensa, dependiendo del tiempo de isquemia, asociada a una disminución del flujo sanguíneo y oxigenación tisular. Como consecuencia de estos fenómenos, aparecerá una alteración en la función hepática9,15,16. En este sentido, por tanto, sería de gran importancia disponer de un test de función hepática rápido y sencillo que traduzca lo que ocurre durante la reperfusión. Existen numerosos tests de función hepática (transaminasas, tiempo de Quick, etc.), pero son poco sensibles, lo que hace necesario encontrar un test lo más fiable posible de reserva funcional hepática17,18.
Fundamentos patogénicos de las lesiones por isquemia-reperfusión
El conocimiento de los fenómenos de isquemia-reperfusión es de gran interés en los trasplantes de órganos, ya que están implicados en los acontecimientos fisiopatológicos de la revascularización del órgano tras la isquemia fría. También existen otras situaciones clínicas frecuentes, como los traumatismos importantes de extremidades, para las que en su tratamiento quirúrgico se precisa mantener la extremidad sin flujo sanguíneo, desencadenándose los fenómenos de isquemia-reperfusión.
Cada órgano o tejido del organismo tiene una sensibilidad y resistencia distinta para la pérdida total o parcial de su flujo sanguíneo, que varía desde pocos minutos en el caso del cerebro, a horas en el caso de las extremidades. Por otro lado, en la situaciones patológicas donde se disminuye de forma aguda o crónica la perfusión sanguínea de los órganos, aparecen lesiones no sólo en el órgano diana, sino también sistémicas. Por ejemplo, en el caso del shock hemorrágico, se puede terminar desarrollando, si la volemia no se restablece adecuadamente, un fallo multiorgánico. Lo mismo puede suceder ante disminuciones del flujo sanguíneo total de un órgano, como es el caso de la embolia mesentérica, etc.
Se han descrito diferentes tipos de isquemia: la isquemia caliente, que sucede con la interrupción del flujo sanguíneo, y en la que la temperatura del órgano se mantiene al mismo nivel que tiene habitualmente en el organismo (fig. 2), y la isquemia fría, que se desarrolla con el órgano fuera del organismo, a una temperatura de 4 °C, con la finalidad de enlentecer el metabolismo del órgano al máximo antes de ser implantado.
Finalmente, con el desarrollo de los donantes a corazón parado se han desarrollado una serie de técnicas de preservación in situ de los órganos para mantenerlos hasta que se pueda hacer la extracción multiorgánica de los mismos, donde el órgano se mantiene a unos 12-14 °C (isquemia tibia) durante el menor tiempo posible.
Durante el proceso de abolición del flujo sanguíneo de un órgano, y su posterior restauración, se desarrollan cronológicamente una serie de lesiones, que en función de su reversibilidad o no van a hacer que un órgano o tejido tenga o no posterior viabilidad funcional.
La primera fase se caracteriza por la lesión isquémica, en la que se interrumpe el aporte de oxígeno al órgano y el metabolismo celular del mismo se transforma de aerobio en anaerobio. A partir de este hecho, si el flujo sanguíneo no se restablece se produce una secuencia de hechos bioquímicos que llevan a la disfunción celular, al edema intersticial y finalmente a la muerte celular. El metabolismo anaerobio existente, junto con el aumento del ácido láctico local, provocan una acidosis metabólica, con disminución del nivel energético que se asocia a alteraciones en el gradiente transmembrana celular que impide el mantenimiento de la homeostasis celular. Con la disminución del nivel energético y degradación de los metabolitos de alta energía aparece una disfunción del sistema de transporte transmembrana que genera un incremento del Ca2+ citosólico. El aumento del Ca2+ activa diferentes sistemas enzimáticos, actuando como segundo mensajero, tales como fosfolipasas y proteasas, implicados fundamentales en la respuesta inflamatoria que posteriormente se desarrollará19. Además, se cambia el flujo de algunos sistemas enzimáticos mediante la activación de la enzima xantina oxidasa y secundariamente a la producción de peróxido de hidrógeno (fig. 1).
La disminución del flujo sanguíneo, durante un período de tiempo predeterminado, puede realizarse de forma ininterrumpida o de forma intermitente, es decir, intercalando entre los períodos de tiempo sin flujo sanguíneo otros con recuperación del flujo tisular del órgano, comprobándose experimentalmente que la función y vitalidad del hígado es la misma al finalizar el período isquémico, con independencia del método que se utilice. Es decir, provoca la misma alteración en el hígado la interrupción continua durante 30 min del flujo sanguíneo que la interrupción del flujo durante 30 min pero en períodos de 10 min4. Se ha demostrado que períodos de tiempo de isquemia mayores de 60 min son capaces de provocar alteraciones irreversibles en la estructura hepática, y estas lesiones irreversibles empeoran cuando a la isquemia se le asocia un período de reperfusión3. Se ha observado que durante la restauración de nuevo del flujo sanguíneo se producen la mayoría de las lesiones o, al menos, se ponen de manifiesto aquellas que se habían iniciado durante la isquemia, denominándose por ello lesión por reperfusión.
Durante la reperfusión, proceso imprescindible para la viabilidad del órgano, se produce el restablecimiento del flujo sanguíneo y se recupera el nivel energético que había disminuido durante la isquemia. También se ponen de manifiesto los efectos de los metabolitos tóxicos, que se habían formado durante la fase previa, que pueden tener repercusión sistémica y local20. Al inicio de la reperfusión aparecen una serie de lesiones, que son distintas de las que aparecen a las 4-6 h del inicio de la reperfusión1.
A nivel sistémico, aparece una acidosis metabólica y una hipercaliemia que, si no se compensan, pueden conducir a la muerte del sujeto. Aparecen, además, mioglobinemia y mioglobinuria, y en el pulmón se describe un aumento de la permeabilidad microvascular y una acumulación de neutrófilos, pudiéndose desarrollar el denominado edema pulmonar no cardiogénico (pulmón de distrés).
A nivel local, en el hígado, durante la reperfusión, aparece el fenómeno de "no reflujo", caracterizado por la imposibilidad de la reperfusión del órgano debido a la obstrucción progresiva en la microcirculación. Aunque no se sabe exactamente su mecanismo de producción, se ha observado que se puede prevenir su aparición con la administración de agentes fibrinolíticos durante el inicio de la reperfusión21 y que, como veremos más adelante, tienen un papel fundamental la adhesión de los leucocitos al endotelio y la activación de éste.
Finalmente, se ha descrito la lesión de preservación, que aparece tras la isquemia fría. Es importante reseñar que los procesos que ocurren durante este período tendrán trascendencia en la viabilidad del injerto una vez trasplantado22.
Se han implicado numerosos metabolitos y células en la lesión por isquemia-reperfusión, con una importancia diferente según el momento en que intervienen en la misma23. A continuación analizaremos los más importantes.
El calcio
Es uno de los primeros implicados en la patogenia de la lesión por isquemia-reperfusión. Durante la isquemia aparece inmediatamente un aumento citosólico del calcio, activándose diferentes sistemas enzimáticos que, con la reoxigenación del órgano, producirán a su vez una activación de los mediadores de la inflamación21.
Se han usado distintos bloqueadores de los canales del Ca2+ en modelos experimentales de isquemia caliente. El verapamilo, el nicardipino y el nimodipino sólo protegen de la lesión por isquemia-reperfusión cuando se administran antes de la realización de la misma, implicándose en su mecanismo de acción protectora la activación de proteasas que convierten la xantina deshidrogenasa en xantina oxidasa24-26. Así mismo, también mejoran la microcirculación durante la reperfusión, aumentando el flujo tisular hepático durante este período25,26.
La utilización de estos antagonistas del calcio en estudios de preservación hepática también ha demostrado la mejor funcionalidad hepática del órgano27,28, aunque otros autores no han encontrado diferencias con respecto al grupo control29.
El papel del Ca2+, por tanto, está todavía en discusión, y se necesitarán nuevos estudios para definir completamente el papel de este ion en la isquemia-reperfusión hepática.
El endotelio vascular
Desempeña un papel muy importante en la lesión por isquemia-reperfusión. Se produce una activación de su superficie endotelial que conlleva la secreción de mediadores de la inflamación que facilitarán posteriormente la penetración de los neutrófilos en el parénquima hepático7. En su superficie se observan receptores para interleucinas, complemento, etc., mediadores que participan en el desarrollo de la lesión por isquemia-reperfusión. Muchas de estas respuestas del endotelio vascular a la lesión no son exclusivas de la lesión por isquemia-reperfusión, sino que también aparecen en la inflamación30.
Entre los mediadores que se han implicado en la lesión por isquemia-reperfusión cabe destacar algunas citocinas. La interleucina 1 y el factor de necrosis tumoral activan la célula endotelial para que exprese las moléculas de adhesión, a la vez que activan a los neutrófilos a través de la interleucina 8. Así mismo, también están implicadas en la producción y modulación de los radicales libres, ya que éstos disminuyen cuando se administran anticuerpos contra la interleucina 131-33.
La endotelina 1 es un potente vasoconstrictor local, derivado de las células endoteliales, que regula fisiológicamente la microcirculación de los tejidos. Se ha comprobado que está implicada en los mecanismos de isquemia-reperfusión. La administración de suero antiendotelina 1 disminuye las lesiones por isquemia-reperfusión al mejorar el flujo sanguíneo local34.
En estudios de isquemia caliente realizados en perros, con diferentes tiempos de isquemia, se ha observado que los valores portales de endotelina son mayores que los sistémicos, y este aumento es más acusado cuanto mayor es el tiempo de isquemia practicado35.
Los neutrófilos
Están implicados en la lesión por isquemia-reperfusión hepática. Su papel ha quedado demostrado, no sólo por su presencia en las muestras anatomopatológicas tomadas tras este fenómeno, sino también en diferentes tipos de estudios funcionales. Cuando se realiza una neutropenia periférica sanguínea, se observa una disminución del número de neutrófilos en el tejido hepático asociado a una disminución de la lesión por isquemia-reperfusión36. En los procesos inflamatorios, la adhesión de los leucocitos a la célula endotelial es un requisito necesario e imprescindible para que migren dentro del tejido lesionado. La migración la realizan a través de las moléculas de adhesión, que se hallan habitualmente en el endotelio vascular del huésped y que son reguladas por el mismo mecanismo de quimiotaxis37.
La mayoría de las lesiones por reperfusión están mediadas por los neutrófilos que se fijan al endotelio a través de una glucoproteína adhesiva, denominada CD 18, que parece ser la señal que necesita el neutrófilo para producir H2O2 y proteasas en el espacio extracelular. Esta adhesión está influida por factores plasmáticos, nucleótidos cíclicos, productos de las lipooxigenasas y factores plaquetarios38. Los neutrófilos se adhieren bien a nivel precapilar o en las vénulas poscapilares, provocando un aumento de la viscosidad sanguínea que podría explicar en parte el fenómeno de "no reflujo" que a veces sucede en la reperfusión19.
Una vez que los neutrófilos han pasando al tejido hepático, se constituyen en una fuente de mediadores citotóxicos, fosfolipasas, peroxidasas, proteasas y radicales libres. Los neutrófilos migran desde el endotelio hacia los hepatocitos, a través de los sinusoides venosos, por un mecanismo que parece dependiente de las integrinas 1. En el caso de una situación de estrés oxidativo están involucradas, además, las integrinas 2, la Mac-1 en el neutrófilo, y la ICAM-1 en la célula endotelial39. Los neutrófilos provocan la lesión celular a través de dos mediadores citotóxicos mayores: los compuestos oxígeno reactivos y las proteasas, sobre todo catepsina y elastasa, que son las responsables de la necrosis parenquimatosa. Durante la preservación fría del hígado se ha demostrado un aumento de la adherencia leucocitaria al endotelio, que es más elevada cuanto mayor es el tiempo de isquemia fría, lo cual podría estar relacionado con el fallo primario del injerto. La importancia de los mecanismos de adhesión leucocitaria varían según el hígado sea sometido a períodos cortos o prolongados de preservación. En el caso de períodos cortos de preservación en la patogenia de la lesión generada, tienen más importancia los radicales libres y las células de Kupffer, mientras que en el caso de períodos prolongados, son las proteínas de las superficie celular las que desempeñan un papel más impor tante22,40,41.
Finalmente, debemos reseñar que los leucocitos activados pueden inducir, por la vía del ácido araquidónico, un incremento de leucotrienos, que también están implicados en la lesión por isquemia-reperfusión42.
Activación del complemento
Durante la isquemia-reperfusión asistimos a la activación del complemento en la superficie endotelial, preferentemente a través de la vía alternativa.
La actividad del complemento es la resultante de la interacción de las proteínas que lo forman, que se encuentran en las membranas celulares y en gran número de proteínas plasmáticas, provocando la opsonización de células fagocíticas y activación de los mecanismos de la inflamación. Cuando se activa localmente, puede inducir la adherencia leucocitaria en el endotelio vascular, diapédesis de los neutrófilos y migración de los mismos a los focos inflamatorios con su posterior descarga de productos citotóxicos y bactericidas43. Con la depleción del complemento se ha conseguido disminuir el infiltrado leucocitario en la zona de isquemia-reperfusión44. Estudios experimentales, con inhibidores solubles del complemento (sCR1) y frente a otros elementos del complemento, han demostrado una disminución de las lesiones por isquemia-reperfusión25,45-49.
Los metales pesados
Son elementos que también se han implicado en la lesión por isquemia-reperfusión. Contribuyen a la desintoxicación y catálisis de los radicales libres. Sobre todo, el hierro y el cobre tienen importancia en la formación de radicales libres, mientras que el selenio es un constituyente de la enzima glutatión peroxidasa, imprescindible para la reducción de los hidroperóxidos lipídicos a su forma análoga. El zinc evita la oxidación de la xantina deshidrogenasa a xantina oxidasa e interactúa con el hierro y el cobre previniendo sus efectos prooxidantes. Además, el zinc, junto con el cobre, es un cofactor de la superóxido dismutasa50.
El hierro puede catalizar la degradación de los lipoperóxidos dentro de compuestos carbonilos citosólicos, como aldheídos e hidroxiálcalis, algunos de los cuales, como el malondialdehído, pueden provocar la rotura de la membrana celular e inactivar los sistemas enzimáticos y de transporte. Durante la isquemia, se produce una acumulación intracelular de hierro y puede ser utilizado posteriormente para la formación de radicales libres derivados del oxígeno. Durante la reperfusión, la administración de desferroxamina (quelante del hierro) ejerce un efecto protector sobre la lesión por isquemia-reperfusión en muchos tejidos del organismo, no sólo en el hígado51.
Secuestrando el hierro, en forma de ferritina, se puede disminuir la producción de radicales libres, ya que la formación de OH necesita la presencia de metales como hierro y cobre para su producción52. Finalmente, algunos autores han demostrado que dietas con sobrecarga de hierro provocan una depleción en los antioxidantes endógenos y, por tanto, aumento de la tendencia oxidante, ocasionando lesiones moderadas53.
Los radicales libres de oxígeno
Son sustancias que tienen uno o varios electrones no apareados en su estructura y han sido ampliamente implicados en la patogenia de la lesión por isquemia-reperfusión54. Por ser sustancias inestables, tienden a producir reacciones en cadena hasta generar compuestos más estables. Durante este proceso se producen compuestos intermedios que pueden o no generar lesiones, dependiendo de los compuestos que alteren o de las reacciones que condicionen.
Los radicales libres se producen de forma fisiológica en el organismo humano en diferentes fuentes: como componentes del sistema de transporte electrónico mitocondrial, en el retículo endoplásmico, durante la síntesis de prostaglandinas y sistemas de las lipooxigenasas, de proteínas y enzimas, y también se producen por autooxidación de numerosos compuestos. De ello se deducen la gran cantidad de relaciones que los radicales libres pueden tener con numerosas situaciones de homeostasis intra y extracelular55.
En situaciones patológicas de reperfusión, tras una disminución o abolición del flujo sanguíneo, las fuentes de radicales libres más importantes son los siguientes sistemas enzimáticos: la xantina oxidasa, la oxidasa NADPH de los neutrófilos, la lipoperoxidación, la oxidasa de las catecolaminas y la síntesis de las prostaglandinas.
El complejo enzimático xantina oxidasa. En el hígado ha sido identificado como una deshidrogenasa tipo D (xantina deshidrogenasa tipo D), dependiente de NAD+ y una oxidasa dependiente de O2 (xantina oxidasa tipo O). La oxidación de la deshidrogenasa tipo D es estimulada por NAD+ con formación de NADP, mientras que la de la deshidrogenasa tipo O no modifica su actividad en presencia del NAD+56. La xantina oxidasa es un complejo molibdoflavoproteína que se asume que es una enzima encargada del catabolismo de las purinas en muchos tejidos, y provoca la oxidación de hipoxantina a xantina y ácido úrico, con la generación del radical superóxido.
En condiciones normales, cerca del 98% de la reducción del oxígeno es catabolizado por el complejo citocromo oxidasa en la mitocondria, produciendo H2O2, que es un compuesto totalmente inocuo, sin la detección de formas intermedias oxígeno reducidas. Según el número de electrones que se reduzcan en el oxígeno molecular, uno, dos o tres, se producen superóxido O2, peróxido de hidrógeno (H2O2), o radical hidróxilo OH, respectivamente. El peróxido de hidrógeno (H2O2) es citotóxico debido a su moderada capacidad oxidativa, siendo usado comúnmente como antiséptico. El radical hidróxilo es extremadamente reactivo e inestable, y un potente oxidante de radicales libres, produciéndose a partir de una reacción catabolizada por metales, entre el O2 y el H2O2. Fisiológicamente provoca un gran daño oxidativo no específico, además de iniciar reacciones radical libre. En cuanto al superóxido, es una sustancia químicamente buena reductora y moderadamente oxidativa, que también puede iniciar reacción radical libre. Puede ser citotóxico en gran número de circunstancias, como son la toxicidad del oxígeno, daño por radiaciones, inflamación mediada por células fagocíticas y la lesión por isquemia57. Sus concentraciones en los tejidos y sangre se han utilizado como un parámetro de actividad radical libre. Así mismo, también se ha estudiado qué células dentro de los tejidos son las que lo producen, observándose que los neutrófilos y las células de Kupffer pueden generarlo, no sólo en situaciones de isquemia caliente, sino también durante la preservación fría58.
Las moléculas radicales libres oxígeno provocan un daño a las membranas celulares, directamente por la peroxidación de los ácidos grasos poliinsaturados y de los fosfolípidos de la membrana. Este fenómeno es producido preferentemente por el anión superóxido o por el radical hidróxilo, aunque también los radicales peróxido lipídicos e hidróxilos lipídicos poseen actividad oxidante y, por tanto, capacidad de ampliar el efecto lesivo. El daño de la membrana celular puede afectar a su integridad o la de organelas celulares importantes, como lisosomas y mitocondrias, comprometiendo seriamente la función celular.
En el proceso de isquemia-reperfusión, durante el período de revascularización, la enzima xantina oxidasa es la mayor fuente de radicales superóxido, los cuales se forman a partir de la hipoxantina, acumulada por la degradación de las moléculas energéticas durante el período de isquemia. La xantina deshidrogenasa tipo D, que es como se encuentra la enzima en los tejidos no lesionados, pasa por una proteasa dependiente del Ca2+ a xantina oxidasa O, durante el período de isquemia, la cual, a su vez, en presencia de oxígeno durante la reperfusión, transforma la hipoxantina a peróxido de hidrógeno, anión hidrógeno y ácido úrico54,59.
Se han descrito dos formas de transformar la xantina deshidrogenasa a xantina oxidasa: una forma irreversible, que sucede en la mayoría de los tejidos, por la acción proteolítica existente durante la isquemia, y otra forma de conversión reversible, que se halla precedida por la disminución de glutatión durante la isquemia. Secuencialmente primero sucede la conversión reversible y con posterioridad la irreversible60.
La administración de anticuerpos contra la xantina oxidasa ha facilitado que se pudiese crear un mapa de su localización, detectándose su presencia en las células endoteliales de muchos tejidos, entre ellos el hígado, corazón, pulmón y riñón, pero no se ha detectado en las células epiteliales de estos órganos, así como tampoco en los leucocitos, linfocitos, macrófagos ni eritrocitos61,62.
Actualmente se discute si la transformación de la xantina deshidrogenasa en xantina oxidasa se produce durante el período de isquemia hepática o en los primeros momentos de la re perfusión. Se ha observado que los valores de hipoxantina y xantina aumentan progresivamente con el mayor tiempo de isquemia, mientras que la cantidad de enzima xantina deshidrogenasa más xantina oxidasa permanece constante durante 90 y 120 min de isquemia y en la reperfusión63. Otros estudios con inhibidores de la xantina oxidasa, como el alopurinol, han demostrado que el estado oxidante durante la reperfusión no es debido únicamente a los radicales superóxido64. Por otro lado, diversos estudios con las técnicas de quimioluminiscencia han demostrado la producción de radicales libres oxígeno durante la isquemia-reperfusión en cultivos celulares hepáticos y de células endoteliales65.
La influencia de los radicales libres en la lesión por isquemia-reperfusión hepática ha quedado patente en diferentes estudios. La administración de scavengers de los radicales libres en diferentes estudios experimentales en perros66, y en modelos de isquemia caliente hepática en ratas67, ha demostrado su efecto protector. En un modelo de isquemia intestinal en gatos se observó una disminución de la lesión hepática y un aumento de la permeabilidad vascular con inhibidores de la xantina oxidasa, comprobándose además que esta enzima es la mayor fuente de radicales libres en el intestino delgado68.
Un marcador de la lesión en la célula endotelial por radicales libres es la concentración de la enzima fosforilasa y de los nucleótidos purina, que se encuentran habitualmente en el citoplasma de la célula endotelial y de la célula de Kupffer. Se ha demostrado que su concentración aumenta con la isquemia y disminuye durante la reperfusión69.
Lipoperoxidación. Otro papel importante de los radicales libres liberados durante la reperfusión es el de iniciar la lipoperoxidación de las membranas celulares, con la consiguiente liberación de sustancias que atraen, activan y promueven la adherencia de polimorfonucleares al endotelio microvascular, aumentando posteriormente la lesión70. Los neutrófilos activados pueden producir a su vez radicales libres, aumentando en sangre los parámetros de lipoperoxidación como el malondialdehído71. En el hígado también se ha observado que la administración de anticuerpos frente a los receptores de los neutrófilos Mac-1 disminuye la lesión hepática, acompañada de una reducción del número de neutrófilos, así como de su estado oxidante, con inactivación de los mismos al reducirse la producción espontánea de anión su peróxido72.
En estudios experimentales de isquemia fría se ha observado que, en ausencia de las células de Kupffer, se produce una disminución en la producción del anión superóxido y liberación del factor de necrosis tumoral (TNF), con una disminución en la acumulación de polimorfonucleares y menor grado de lesión celular58.
Los scavengers o eliminadores de los radicales libres no sólo disminuyen la producción de hidrolipoperóxidos, sino también la producción de tromboxano A, no modificándose la producción de prostaciclinas. Por tanto, posibilitan un posible papel de las prostaglandinas en la lesión por isquemia-reperfusión5. También se ha demostrado que la administración de PGE1, en el líquido de preservación o en el inmediato postoperatorio, disminuye la producción del anión superóxido y mejora la preservación del injerto y la funcionalidad hepática73. Por otro lado, la administración de sustancias que aumentan la producción de las prostaglandinas puede disminuir la lesión por isquemia reperfusión, ya que aumentan los nucleótidos de alta energía74.
Los radicales libres generan la peroxidación de metabolitos, con lo que el estudio de estos metabolitos y de sus derivados se considera una forma indirecta de valorar la función de los radicales libres75. El estado antioxidante del organismo se modifica por multitud de causas, entre ellas la lesión por isquemia-reperfusión76. Estos productos de la lipoperoxidación desempeñan un papel importante en la lesión oxidativa por generar ella misma reacciones radical libre. Algunos de sus productos de degradación son tóxicos por sí mismos (aldehídos) y generan un aumento de la reducción del sistema de desintoxicación glutatión dependiente y, por tanto, disminuyen las defensas celulares para desintoxicar otras sustancias9. Se ha demostrado que la lipoperoxidación de la membrana celular generada por los radicales libres se produce en mayor grado en las células no parenquimatosas que en los hepatocitos15.
El óxido nítrico
Un mediador que se ha considerado de suma importancia en la patogenia de la lesión por isquemia reperfusión es el óxido nítrico (NO) o factor de relajación endotelial. Se forma a partir de la L-arginina mediante la acción de la enzima NO sintetasa, que es dependiente del NADPH, calcio y calmodulina, inhibiéndose por análogos de la arginina. El NO difunde al espacio muscular liso vascular adyacente, donde se une a la guanilato ciclasa y provoca la relajación del músculo liso. Tiene una vida media muy corta, de segundos, lo que hace que sean difíciles su estudio y determinación analítica12. En el organismo humano se produce en las arterias y venas, contribuyendo a la modulación del flujo sanguíneo local. En el espacio intravascular inhibe la adhesión y agregación plaquetaria, lo que le confiere propiedades útiles para su aplicación clínica77. Disponemos actualmente de los valores normales plasmáticos para la población adulta78.
De la enzima oxido nítrico sintetasa se han determinado tres formas diferentes: una de ellas inducible y calcio dependiente, que se expresa en condiciones patológicas, y dos isoformas de la enzima constituyente, que son las encargadas de provocar sus efectos en condiciones fisiológicas. Su inhibición provoca un importante descenso de la microcirculación hepática, mientras que su estímulo induce un aumento del flujo microvascular79. Su síntesis se regula por la concentración de glutatión, importante cofactor para gran número de sistemas enzimáticos, entre los que se encuentra la óxido nítrico sintetasa inducible80.
Las acciones del óxido nítrico sobre el organismo pueden ser protectoras o deletéreas, según en qué sistema biológico u órgano estudiado nos encontremos81. La acción relajante del óxido nítrico se prolonga por la administración de superóxido dismutasa, lo que demuestra que su acción está modulada por los radicales libres derivados del oxígeno82,83; su acción es inhibida por los radicales superóxido e hidróxilo84.
En el hígado se ha observado que puede ejercer tanto acciones prooxidantes como antioxidantes, siendo considerado por algunos autores como un parámetro de seguimiento de algunas enfermedad hepáticas81. En estudios in vitro actúa como antioxidante, evitando el efecto oxidativo mediado por el hierro85. En la lesión por reperfusión se ha observado que posee un efecto favorable sobre la microcirculación y disminuye la extensión de la necrosis hepática86. Si se administra antes de la realización de la isquemia hepática, disminuye la lesión por isquemia-reperfusión13.
Antioxidantes
Los antioxidantes son agentes endógenos o exógenos que pueden prevenir la acción de los radicales libres derivados del oxígeno y, por tanto, disminuir la lesión mediada por estos radicales. Los antioxidantes pueden actuar bien eliminando directamente los radicales libres, en cuyo caso se les denomina scavengers, o bien bloqueando la generación de éstos o sus efectos deletéreos51,87-93.
Existen diferentes clasificaciones de los antioxidantes en la bibliografía. Nosotros vamos a describir la que utiliza como criterio de clasificación el modo de acción. Los fármacos con capacidad antioxidante se pueden dividir en cinco grupos fundamentales: scavengers o eliminadores de los radicales libres, inhibidores de la producción de radicales libres, inhibidores de los neutrófilos, inhibidores de la peroxidación y los condicionantes de la situación oxidativa y energética preisquémica87,88 (tabla 1).
En la literatura científica se han descrito numerosas sustancias con efecto antioxidante y eficaces para la prevención de la lesión por isquemia-reperfusión. Gran parte de las mismas han demostrado su efecto protector en diferentes estudios experimentales de isquemia-reperfusión hepática66-68,92,93. A continuación, vamos a analizar en profundidad los mecanismos de acción de diferentes fármacos que han sido reconocidos como antioxidantes bioquímicos y que en nuestro laboratorio hemos investigado su efecto fisiológico o protector sobre la función hepática67.
Superóxido dismutasa (SOD)
Es el scavenger o eliminador de los radicales libres superóxido más conocido. De forma fisiológica, su acción, en el metabolismo hepático, es la de formar peróxido de hidrógeno a partir de la xantina y el anión superóxido.
Su administración de forma exógena tiene la limitación de su corta vida media, aunque se dispone de formas comercializadas que alcanzan una vida media de hasta 4-6 h.
La administración de SOD mejora la lesión por isquemia-reperfusión en diferentes modelos experimentales94. Se ha descrito un aumento de la producción de bilis y disminución de transaminasas95. Esta mejoría es mayor cuando se administra previa a la isquemia, ya que disminuye el grado de necrosis anatomopatológica11.
Durante la isquemia hepática disminuyen las concentraciones de SOD junto al incremento de las concentraciones de hipoxantina y xantina, mientras que en la postisquemia predomina el descenso de las concentraciones de ATP63. Esto explica que la administración exógena de SOD antes de la isquemia mejore la funcionalidad hepática96. Se ha demostrado que la administración de SOD también disminuye la formación de radicales libres durante la reperfusión y, por tanto, mejora la lesión por reperfusión94,98. Por otro lado, en modelos de hepatectomía parcial en ratas, su administración disminuye la lipoperoxidación y favorece la regeneración hepática97.
Alopurinol
Se trata de un inhibidor de la enzima xantina oxidasa, ampliamente usado en la clínica para el tratamiento de la hiperuricemia. Ejerce una acción inhibidora de la producción de radicales libres al impedir el paso de hipoxantina a xantina y anión superóxido.
En el hígado se ha observado que, durante la isquemia-reperfusión, el alopurinol, además de su acción inhibidora sobre los radicales libres, produce un aumento en la síntesis de proteínas sin alterar la concentración de los nucleótidos energéticos99. Tampoco interfiere con los valores hepáticos de glutatión durante la reperfusión100.
Se ha comprobado que el alopurinol disminuye en mayor grado los efectos de la isquemia caliente hepática cuando se administra antes de la isquemia, independientemente de la dosis o vía de administración utilizada 101, necesitándose al menos dos dosis en un período de 24 h para que pueda ejercer su acción inhibitoria sobre la xantina oxidasa102.
Los estudios en modelos de isquemia caliente hepática demuestran que mejora la producción de ATP y de bilis, por medio de un efecto scavenger directo, o bien por una resíntesis del ATP, a partir de la hipoxantina acumulada durante la isquemia64,103,104.
El efecto beneficioso del alopurinol en la isquemia-reperfusión hepática, mediado por los radicales libres, también ha quedado demostrado por técnicas de quimioluminiscencia105.
Vitamina E
La vitamina E o tocoferol forma parte del grupo de las vitaminas liposolubles y se la considera la vitamina más antioxidante de las membranas celulares106-109.
De las diferentes formas bioquímicas de los tocoferoles, el que presenta mayor número de grupos metilados en su estructura es el más activo y corresponde al alfatocoferol, del que existen siete isómeros. El d-alfatocoferol es el que presenta un 100% de actividad y es transportado en el plasma por las lipoproteínas de bajo peso molecular, alcanzando una concentración en tejido hepático humano de 13 µ g/g de peso en fresco.
Debido a la gran lipofilidad de la vitamina E y, por tanto, a la imposibilidad de su administración intravenosa, se han desarrollado análogos de la misma, como el Trolox, con actividad hidrofílica, que pueden administrarse por vía intramuscular o intrave nosa110,111.
La vitamina E es uno de los primeros compuestos que se utilizó experimentalmente para prevenir la lesión la isquemia-reperfusión hepática112.
En estudios de isquemia caliente hepática se ha demostrado que produce un aumento de la resíntesis de ATP, una disminución en la producción de los lipoperóxidos y un aumento del glutatión reducido durante la reperfusión, aminorando de esta forma la lesión por isquemia-reperfusión113,114.
Captopril
Los inhibidores de la enzima conversiva de la angiotensina (IECA) son fármacos ampliamente estudiados, y utilizados en la práctica clínica diaria. El captopril es un IECA dotado con un grupo sulfhidrilo en su estructura, habiéndose demostrado que aumenta la producción de óxido nítrico por parte de la célula endotelial en situación de estrés115. Además, aumenta las defensas antioxidantes en diferentes tejidos y órganos, como el corazón, la médula renal y el hígado116-118.
El captopril es, de todos los IECA, el que presenta una mayor actividad antioxidante, siendo dosis dependiente119. Además, posee un efecto eliminador o scavenger de los radicales libres derivados del oxígeno, por la presencia en su estructura de un radical sulfhidrilo (SH)120-122.
Los estudios experimentales sobre isquemia-reperfusión hepática han demostrado que el captopril aumenta la actividad de la superóxido dismutasa y de la glutatión peroxidasa hepática. Este aumento de la actividad enzimática podría deberse a un efecto directo sobre la síntesis de estas enzimas, o bien tratarse de un efecto secundario de la acción metabólica de los ECA. Por otra parte, la actividad superóxido dismutasa humana está regulada por péptidos de bajo peso molecular, considerándose al captopril un análogo de estos123.
Durante la isquemia-reperfusión hepática, produce un aumento de los derivados del ácido araquidónico, la prostaglandina E y la endotelina 1, compuestos que actualmente se sabe que están implicados en la patogenia de la lesión por isquemia-reperfusión hepática. Por tanto, se aprecia que aparte del efecto sobre los radicales libres también tiene implicaciones en otros mecanismos patogénicos de la lesión por isquemia-reperfusión124.
Propranolol
El propranolol es un fármaco con efecto bloqueador beta no selectivo, ampliamente utilizado en la práctica clínica diaria2, que actúa estabilizando la membrana celular125,126.
El posible efecto antioxidante de los bloqueadores beta ha sido considerado desde hace años, aunque son limitados los estudios sobre el mismo126-128.
No existen trabajos sobre el posible efecto del propranolol sobre la isquemia-reperfusión hepática, pero se ha descrito la mejoría en la función cardíaca126.
N-acetilcisteína (NAC)
La N-acetilcisteína es un derivado tiólico, fundamental para la síntesis de glutatión en numerosos tejidos. Se ha demostrado que en altas concentraciones protege a las células del daño oxidativo mediante dos mecanismos40,129: a) por su efecto antioxidante directo neutralizando el H2O2, y b) aumentando las reservas citoplasmáticas de glutatión. También se ha sugerido que puede proteger al ácido nítrico de los procesos de oxidación. Se conoce el efecto protector del NAC en situaciones de fallo hepático fulminante49, y se ha sugerido su efecto protector hepático en el modelo de isquemia-reperfusión17. Por tanto, se ha postulado su posible uso clínico en cirugía hepática y durante el trasplante hepático130, pero los resultados beneficiosos todavía no han podido ser demostrados.
En nuestro laboratorio de cirugía experimental hemos es tudiado en profundidad el posible efecto fisiológico poten cialmente beneficioso que sobre el hígado, sometido a una isquemia-reperfusión controlada, pueden tener estos scavengers6,14,18,25,36,45,66-68. El efecto protector bioquímico está demostrado desde hace tiempo. Queda por demostrar, de cara a la aplicabilidad clínica, la mejoría en la función, ya que no siempre existe una correlación entre el efecto bioquímico y la mejoría funcional. Nuestros resultados apoyan que, a pesar de que todos estos scavengers tienen efectos bioquímicos, sólo parte de ellos mejoran la microcirculación hepática lo suficiente para encontrar un claro efecto beneficioso fisiológico67. De estos scavengers, sólo demostramos un efecto beneficioso sobre la microcirculación hepática durante la reperfusión, cuando se administró SOD o tocoferol. La función hepática sólo mejoró significativamente con la SOD. Estos resultados ponen a debate el efecto beneficioso funcional de estos scavengers y constituyen un ejemplo de la necesidad de estos estudios experimentales antes de plantear los ensayos clínicos130.
Perspectivas de futuro e implicaciones clínicas
Los estudios clásicos de isquemia-reperfusión hepática han consistido en el estudio de todos los complejos acontecimientos que afectan a los distintos componentes celulares y que finalmente conducen al daño celular irreversible.
Uno de los mecanismos de daño celular recientemente referido es la rotura del ADN por los radicales libres que se generan durante la isquemia-reperfusión. Sin embargo, los mecanismos íntimos del daño, las consecuencias y los procesos de reparación del ADN son poco conocidos. Existe una intrincada red de vigilancia que protege a la célula de la acumulación de lesiones genómicas no reparadas o reparadas inadecuadamente131,132. La activación de sistemas enzimáticos destinados a reparar el ADN lleva como consecuencia el consumo elevado de nucleótidos de alta energía, con un desequilibrio en la cadena energética, con consumo de NAD y depleción de ATP133. El rango exacto de funciones de estas enzimas reparadoras no está claramente establecido. Sin embargo, se cree que están involucradas en la transferencia catalítica de unidades de NAD-ribosa destinadas a reparar el ADN134. En casos de severo estrés celular, como el de la isquemia-reperfusión, la activación de los sistemas reparadores de ADN puede eventualmente conducir a la muerte celular por depleción de energía. Mejorar los conocimientos de estos mecanismos podría tener aplicación directa en el área de la preservación de órganos y mejoría de la funcionalidad de injertos subóptimos para trasplante.
El modelo de isquemia-reperfusión en la rata permite realizar estudios farmacológicos para comprobar el efecto beneficioso o protector hepático en diferentes localizaciones (bioquímica, fisiológica, histológica y funcional), y poder, de esta manera, elegir los agentes que sean más beneficiosos sobre la función hepática y ensayarlos en diferentes situaciones clínicas de isquemia-reperfusión, como pueden ser el trasplante o las resecciones hepáticas67,130,135-138.
