El tratamiento antirretroviral de gran actividad (TARGA) consiste en la combinación de diversos fármacos antirretrovirales, por lo general un análogo nucleósido, un inhibidor de proteasas (IP) y un tercer fármaco que puede ser un segundo análogo de nucleósidos o un inhibidor de la transcriptasa inversa de tipo no nucleósido. Desde la introducción de este esquema terapéutico, se ha evidenciado en la población con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) un aumento de la supervivencia, una menor progresión de la enfermedad y un descenso de los ingresos hospitalarios y costes asociados1,2.
Sin embargo, la dislipemia, la redistribución de la grasa corporal y la resistencia a la insulina, constituyen importantes problemas asociados a este tratamiento3. Aunque los diversos agentes farmacológicos que configuran el TARGA parecen tener distintos efectos sobre el perfil lipídico4, habitualmente hay una elevación de las concentraciones de colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (cLDL) y de triglicéridos, y una reducción del colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (cHDL), junto con resistencia a la insulina5. Estas anomalías se atribuyen principalmente al uso de IP; en particular, la utilización de ritonavir se asocia a un riesgo de hipercolesterolemia mayor que otros IP, como nelfinavir e indinavir5. Cabe destacar que gran parte de los efectos asociados al uso de TARGA coinciden con las características del síndrome metabólico6.
Poco después de la introducción del TARGA se describieron los primeros indicios de que los pacientes con infección por el VIH en tratamiento presentaban un notable incremento del riesgo cardiovascular, hecho confirmado recientemente en 2 amplios estudios prospectivos7,8. Sin embargo, el mecanismo exacto por el que se produce aterosclerosis precoz en los pacientes con infección por el VIH y en qué grado la utilización del TARGA contribuye al establecimiento de la aterosclerosis se desconocen todavía.
Entre los mecanismos que conducen a la formación de lesiones ateroscleróticas, uno de los fenómenos iniciales es la acumulación de lípidos en el interior de los macrófagos, lo que genera las células espumosas. Dicho acúmulo se produce como consecuencia de un desequilibrio entre los procesos que aportan colesterol a la célula y los mecanismos que promueven su eliminación. En el primer caso, la entrada masiva de lípidos en el macrófago de forma no regulada por las concentraciones intracelulares de colesterol se produce como resultado de la internalización de LDL modificadas a través de los receptores scavenger, principalmente el receptor de clase B CD369. En lo referente al proceso de eliminación de colesterol, éste está mediado principalmente por el transportador ABCA1, que facilita el eflujo de colesterol y fosfolípidos hacia la apolipoproteína A-I10 y por el receptor scavenger de tipo B clase I (SR-BI) o su homólogo humano CLA-1, que promueve el eflujo de colesterol hacia las HDL11.
Algunos estudios recientes han intentado elucidar el mecanismo por el cual los IP promueven el desarrollo de la aterosclerosis, centrándose en el monocito/macrófago como célula clave en este proceso y en la expresión de CD3612-14. En el primero de estos estudios12, se analizó el efecto de un tratamiento con fármacos antirretrovirales durante 7 días sobre las concentraciones de CD36 en monocitos de voluntarios sanos y de pacientes infectados por el VIH. Se demostró una reducción significativa de las concentraciones de CD36 en el 70% de los participantes. En contraposición, los resultados de los otros estudios13,14 indican que diversos IP inducen la expresión de CD36 y la acumulación de ésteres de colesterol en monocitos/macrófagos humanos in vitro13. En cuanto al mecanismo por el que los IP inducen la expresión de CD36, éste podría estar relacionado con la activación del receptor activado por proliferadores de peroxisomas g (PPARg) y con la acumulación de la forma madura de sterol reponse element binding proteins (SREBP)13.
Resulta evidente que las alteraciones en la expresión de CD36 pueden desempeñar un papel importante en el desarrollo de la aterosclerosis mediada por el TARGA. Sin embargo, hay notables discrepancias entre los estudios publicados, que pueden atribuirse a diferencias en el diseño experimental, en parte relacionadas con la concentración de fármaco o con el tipo y/o estado de diferenciación de las células estudiadas (monocitos o macrófagos). Por otro lado, no se dispone de información acerca de posibles modificaciones en la expresión de otros genes tan importantes como CD36 en el proceso de acumulación de lípidos en monocitos y macrófagos, concretamente SR-BI y ABCA1. Las modificaciones en la expresión de estos genes podrían contribuir o contrarrestar, según que el efecto fuera de represión o de inducción, la acumulación de colesterol en dichas células. El presente trabajo se ha diseñado con la finalidad de aportar respuestas a estos interrogantes.
Material y método
El ritonavir utlilizado en este estudio fue proporcionado por Abbot Laboratories (Chicago, EE.UU.). Los reactivos usados para el cultivo celular proceden de Gibco, Invitrogen (Paisley, Reino Unido). El suero bovino fetal, el 4-beta forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). El reactivo Trizol utilizado para la obtención del ARN total y los reactivos usados para la reacción de la transcriptasa inversa acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) son de Invitrogen (Paisley, UK), a excepción de los random hexamers y los oligonucleótidos específicos o primers obtenidos de Roche Diagnostics (Mannheim, Alemania), y el a-[32P]dATP, de Amersham Biosciences (Freiburg, Alemania). Los anticuerpos contra ABCA1 y SR-BI son de Novus Biologicals, contra SREBP-1 de Santa Cruz, y el anticuerpo anti-b-actina se obtuvo de Sigma-Aldrich. El resto de reactivos utilizados son de grado analítico y se obtuvieron de fuentes comerciales.
Cultivo celular
La línea de leucemia monocítica humana THP-1 se obtuvo de la European Collection of Cell Cultures (ECACC), y se mantuvo en medio RPMI 1640 con 25 mM de tampón Hepes, suplementado con un 10% de suero bovino fetal, un 1% de L-glutamina 200 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina a 37 °C en un 5% de CO2.
Las células se utilizaron sin diferenciar (monocitos) o tras la diferenciación con PMA durante 24 h. Después de 3 lavados, se incubaron las células durante otras 24 h con ritonavir (0,05-2,5 µg/ml) disuelto en etanol (concentración final de etanol en el medio de cultivo: 0,1%). La viabilidad celular se determinó por el método MTT15.
Expresión de CD36 en superficie
El análisis de la expresión de CD36 en la superficie celular se realizó por citometría de flujo utilizando un anticuerpo contra CD36 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), de Serotec. Las células se cultivaron y trataron como se ha indicado, y al finalizar el tratameinto se lavaron las placas y se incubaron con PBS que contenía un 0,5% de BSA y EDTA 2 mM. La suspensión celular se centrifugó (10 min, 1.000 g, 4 °C), y el pellet se resuspendió y se incubó con el anticuerpo conjugado con FITC durante 30 min a 4 °C en la oscuridad. Tras un lavado con PBS frío, la fluorescencia se analizó con un citómetro de flujo (Epics XL).
Preparación y análisis del ARN
El ARN total se aisló mediante el reactivo Trizol, siguiendo las indicaciones del fabricante. Las concentraciones relativas de ARN mensajero (ARNm) se determinaron mediante la reacción de la RT-PCR. El ADN complementario (ADNc) se sintetizó a partir de 0,5 µg de ARN total mediante su incubación con 125 ng de random hexamers en presencia 75 mM de KCl, 3 mM de MgCl2, 10 mM de ditiotreitol, 200 U de la enzima M-MLV-transcriptasa inversa, 20 U ARNsin y 0,5 mM de cada dNTP en un volumen total de 20 µl de tampón Tris/HCl, 50 mM, pH 8,3. La reacción se llevó a cabo a 37 °C durante 1 h. Una alícuota de 5 µl de la reacción de RT se utilizó para la reacción de amplificación de PCR junto con los oligonucleótidos específicos. Así, cada 50 µl de la reacción de PCR contenían 5 µl de la reacción de RT, 1,2 mM MgCl2, 200 M dNTP, 0,25 µCi a-[32P]dATP (3.000 Ci/mmol), 1 U de TaqADN polimerasa, 0,5 µg de cada oligonucleótido específico (sentido y antisentido) en tampón Tris/HCl, 20 mM, pH 8,5. Para evitar posibles hibridaciones inespecíficas, el ADNc y la Taq polimerasa se separaron de los oligonucleótidos específicos y de los dNTP mediante una capa de parafina; de este modo, sólo entran en contacto cuando la parafina funde a 60 °C. Las secuencias de los oligonucleótidos sentido y antisentido utilizadas para estudiar cada uno de los genes fueron CD36, 5'-CTGTGACCGGAACTGTGGGCT-3' y 5'-GAA GATGGCACCATTGGGCTG-3'; ABCA1, 5'-GGAGGCAATGGCACTGAGGAA-3' y 5'-CCTGCCTTGTGGCTGGAGTGT-3'; SR-BI: 5'-ACGACACCGTGTCCTTCCTCG-3' y 5'-CGGGCTGTAGAACTCCAGCGA-3'; PPARg, 5'-CATTCTGGCCCACCAACTTTGG-3' y 5'-TGGAGATGCAGGCTCCACTTTG-3'; y gapdh, 5'-CAGTCCATGC CATCACTGCCA-3' y 5'-AGGTGGAGGAGTGGGTGTCGC-3'. La PCR se realizó en un termociclador MJ Research equipado con un sistema Peltier y una sonda de temperatura. Después de una desnaturalización de 1 min a 94 °C, la PCR se llevó a cabo en 20 (PPARg), 19 (SR-BI) y 18 (CD36, ABCA1) ciclos de amplificación. Cada ciclo consistió en una desnaturalización a 92 °C durante 1 min, una hibridación con los oligonucleótidos específicos a 60 °C durante 1 min y 15 s, y una etapa de síntesis a 72 °C durante 1 min 50 s. La reacción se terminó, al final del último ciclo de amplificación, con 5 min de síntesis final a 72 °C. Un total de 5 µl de la PCR se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 5% y los productos de amplificación se visualizaron mediante autorradiografía (Agfa, Medical X-ray film). La amplificación de cada gen dio lugar a la visualización de una sola banda del tamaño esperado (PPARg, 229 bp; ABCA1, 181 bp; CD36, 361 bp; SR-BI, 509 bp, y gapdh, 302 bp). Para cada uno de los genes estudiados se realizaron ensayos preliminares de número de ciclos de amplificación y cantidad de ADNc a amplificar para determinar las condiciones óptimas de trabajo (por debajo del límite de saturación). Finalmente, la intensidad de las bandas se cuantificó por densitometría (Vilbert Lourmat Imaging). Este método permite la cuantificación relativa de las concentraciones de ARNm de cada uno de los genes estudiados, normalizados utilizando la gapdh como control interno.
Análisis de Western blot
Se sometieron 40 µg de extracto de proteína total a electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida (12,5%). Posteriormente, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (Immobilon-P de Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Las membranas se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente en tampón TBS que contenía un 5% de leche en polvo no grasa, y la inmunodetección se realizó utilizando anticuerpos policlonales de conejo contra SR-BI o ABCA1 (dilución 1:500 en solución de bloqueo, durante 1,5 h en el caso de SR-BI o durante toda la noche en el caso de ABCA1). Dichas membranas se lavaron 3 veces durante 5 min (más un lavado adicional de 15 min en el caso de ABCA1), antes de proceder a su incubación con un anticuerpo secundario adecuado (dilución 1:2.000), durante 2 h. Las membranas también se incubaron con un anticuerpo monoclonal anti-b-actina (dilución 1:5.000), para comprobar que la carga de proteína entre las distintas muestras era equivalente. El tamaño de las proteínas detectadas se estimó utilizando estándares de peso molecular (BioRad). La inmunodetección se llevó a cabo por quimioluminiscencia utilizando el enhanced chemiluminiscence (ECL) detection system (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La quimioluminiscencia se detectó mediante un detector Chemidoc XRS (BioRad) y el análisis densitométrico de las bandas se realizó utilizando el programa informático Quantity One®. Los resultados se expresan en unidades arbitrarias en relación con el control, una vez normalizados respecto la b-actina.
Obtención de extractos nucleares y determinación de SREBP1
Macrófagos THP-1 diferenciados durante 24 h se incubaron con ritonavir (2,5 µg/ml) durante 6 y 24 h. A partir de dichos macrófagos se prepararon extractos nucleares utilizando triton al 0,03% para lisar las células. Tras la cuantificación de la concentración proteica, 30 µg de los extractos nucleares se sometieron a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (10%). Posteriormente, las proteínas se transfirieron a membranas de PVDF (Immobilon-P), que se incubaron con un anticuerpo policlonal contra la SREBP-1 humana (dilución 1:200) durante toda la noche a 4 °C. Después de diversos lavados, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario adecuado durante 1 h. La igualdad de carga de proteína en cada carril se verificó por incubación con un anticuerpo monoclonal contra la b-actina (dilución1:500). La inmunodetección se llevó a cabo por quimioluminiscencia mediante el Chemidoc XRS (BioRad) y el programa Quantity One®.
Análisis estadístico
Los resultados mostrados corresponden a la media ± desviación estándar de un mínimo de 3 experimentos realizados por duplicado. La significación estadística de las diferencias se evaluó mediante el test ANOVA combinado con el test de la t de Student-Newman-Keuls, utilizando el programa informático GraphPad Instat.
Resultados
Ritonavir modifica la expresión de CD36 según el estado de diferenciación celular
Debido a los resultados contradictorios obtenidos en estudios previos, y que podían deberse a diferencias en el tipo de célula o en el grado de maduración del monocito-macrófago, se evaluó el efecto del ritonavir en una misma línea celular monocítica (THP-1) sin diferenciar o tras la diferenciación por exposición a PMA durante 24 h. Teniendo en cuenta que en los estudios existentes la concentración de ritonavir utilizada era muy distinta (desde 0,03 hasta 10 µg/ml), las células se trataron con concentraciones crecientes de ritonavir y se evaluó la posible citotoxicidad por la técnica de MTT. Los resultados muestran que la utilización de concentraciones de ritonavir > 2,5 µg/ml produce efectos citotóxicos inaceptables, por lo que se decidió trabajar en el rango de 0,05 a 2,5 µg/ml. Como se muestra en la figura 1A, las concentraciones de proteína CD36 en la superficie celular no resultan modificadas de forma significativa en monocitos no diferenciados. En cambio, en macrófagos diferenciados con PMA durante 24 h, el tratamiento con ritonavir aumenta la expresión de CD36 en la superficie celular (el 28% de inducción a la concentración de 2,5 µg/ml; p < 0,05) (fig. 1B).
Figura 1. El ritonavir incrementa la expresión de CD36 en macrófagos pero no en monocitos THP-1. A) Análisis de la expresión en la superficie celular de CD36 en monocitos THP-1 incubados con distintas concentraciones (0,05-2,5 mg/ml) de ritonavir durante 24 h. B) Análisis de la expresión en la superficie celular de CD36 en macrófagos THP-1 incubados con distintas concentraciones (0,05-2,5 mg/ml) de ritonavir durante 24 h. C) Análisis de las concentraciones de ARNm de CD36 en macrófagos THP-1 expuestos a ritonavir (0,05-2,5 mg/ml) durante 24 h. Se muestran autorradiografías representativas y las cuantificaciones correspondientes a las concentraciones de ARNm normalizados por el gen control gapdh. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar de 3-4 experimentos independientes realizados por duplicado. *p < 0,05 respecto las correspondientes células control.
Ritonavir afecta la expresión de proteínas relacionadas con el eflujo de colesterol
En función de los resultados obtenidos, se decidió continuar el estudio con células diferenciadas durante 24 h, evaluando el posible efecto de ritonavir sobre 2 proteínas implicadas en el eflujo de colesterol, ABCA1 y SR-BI. La figura 2A muestra que el tratamiento con ritonavir incrementa las concentraciones de proteína de ABCA1 a las concentraciones más altas, y el efecto máximo (el 83% de incremento; p < 0,05) se observa a 1 µg/ml. Por el contrario, las concentraciones de proteína de SR-BI disminuyen un 46% a la concentración de 2,5 µg/ml (p < 0,05) (fig. 3A).
Figura 2. El ritonavir induce la expresión de ABCA1 en macrófagos THP-1. A) Se trataron macrófagos THP-1 con varias concentraciones (0,052,5 mg/ml) de ritonavir durante 24 h. Las concentraciones de proteína ABCA1 se determinaron según se indica en "Material y método". B) Se incubaron macrófagos THP-1 con ritonavir 1 y 2,5 mg/ml durante 24 h. Las concentraciones de ARNm correspondientes a ABCA1 se determinaron por RT-PCR según se indica en "Material y método". Se muestran autorradiografías representativas y las cuantificaciones correspondientes. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar de 3-6 experimentos independientes. *p < 0,05 respecto a las correspondientes células control.
Figura 3. El ritonavir reduce las concentraciones de proteína SR-BI pero no modifica la expresión del ARNm en macrófagos THP-1. A) Se trataron macrófagos THP-1 con varias concentraciones (0,05-2,5 mg/ml) de ritonavir durante 24 h. Las concentraciones de proteína SR-BI se determinaron según se indica en "Material y método". B) Se incubaron macrófagos THP-1 con ritonavir 1 y 2,5 µg/ml durante 24 h. Las concentraciones de ARNm correspondientes a SR-BI se determinaron por RT-PCR tal y como se indica en "Material y método". Se muestran autorradiografías representativas y las cuantificaciones correspondientes. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar de 3-5 experimentos independientes. *p < 0,05 respecto a las correspondientes células control.
Efecto del ritonavir sobre los valores de ARNm de CD36, ABCA1 y SRBI
Con el objetivo de comprobar si las modificaciones en las concentraciones de proteína se produ cían a través de un mecanismo transcripcional, se trataron los macrófagos THP-1 con 1 y 2,5 µg/ml de ritonavir, y se determinaron las concentraciones de ARNm de CD36, SR-BI y ABCA1 por la técnica de RT-PCR. El tratamiento con ritonavir a la concentración de 2,5 µg/ml produce un aumento del 38% en las concentraciones de ARNm de CD36 (p < 0,05) (fig. 1C). También se incrementa de forma significativa el ARNm de ABCA1 a las 2 concentraciones ensayadas (el 32 y el 49%, respectivamente; p < 0,05) (fig. 2B), mientras que no se observan reducciones significativas en la expresión del ARNm de SR-BI (fig. 2C).
La expresión de PPARg se incrementa en macrófagos tratados con ritonavir
Para profundizar en el mecanismo a través del cual el ritonavir modifica la expresión de CD36, se determinó la expresión del ARNm de PPARg tras el tratamiento con ritonavir a las mismas concentraciones. Como se puede observar en la figura 4, las concentraciones de ARNm de PPARg se incrementan un 51% a la concentración máxima de ritonavir utilizada (p < 0,05).
Figura 4. El tratamiento con ritonavir induce la expresión de PPARg en macrófagos THP-1. Análisis de las concentraciones de ARNm de PPARg en células THP-1 tratadas con ritonavir (1 y 2,5 mg/ml) durante 24 h. Se analizaron 0,5 mg de ARN total por RT-PCR como se describe en "Material y método". Se muestran autorradiografías representativas y las cuantificaciones correspondientes a las concentraciones de ARNm normalizadas por el gen control gapdh. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar de 6 experimentos independientes realizados por duplicado. *p < 0,05 respecto a las correspondientes células control.
Efecto de ritonavir en las concentraciones de SREBP-1 en macrófagos
Debido a la existencia de estudios previos en los que se sugiere que los inhibidores de proteasas pueden modular las concentraciones de CD36 y PPARg por un efecto mediado por SREBP, se determinó el efecto de ritonavir, a la concentración de 2,5 µg/ml, en el valor de la forma madura, transcripcionalmente activa de SREBP-1 en extractos nucleares. En la figura 5 se muestra que el tratamiento con ritonavir durante 6 h produce una reducción transitoria en la expresión de la forma madura de SREBP-1 (el 50%; p < 0,05), pero que las concentraciones de esta proteína retornan a los valores control en tratamientos de 24 h.
Figura 5. Efecto del ritonavir sobre las concentraciones de la forma madura de SREBP-1. Análisis de las concentraciones de proteína SREBP1 en extractos nucleares obtenidos a partir de macrófagos THP-1 control y tratados con 2,5 mg/ml de ritonavir durante 6 y 24 h. Se muestran autorradiografías representativas y las cuantificaciones correspondientes a las concentraciones de proteína normalizadas por la b-actina. Los datos se expresan como la media ± desviación estándar de 4 experimentos independientes realizados por duplicado. *p < 0,05 respecto a las correspondientes células control.
Discusión
En el presente estudio se han determinado los efectos del ritonavir sobre la expresión de proteínas que controlan las concentraciones intracelulares de colesterol en un modelo de monocito-macrófago, la línea celular THP-1. Las concentraciones de ritonavir utilizadas se hallan dentro del rango que se alcanza en el plasma de pacientes tratados con dicho fármaco a la dosis recomendada (600 mg de ritonavir/12 h), que puede llegar a un máximo de aproximadamente 11 µg/ml14. Algunos autores utilizan concentraciones de ritonavir muy elevadas (hasta 20 µg/ml) en células THP-114, pero según nuestra experiencia, concentraciones > 2,5 µg/ml resultan citotóxicamente inaceptables. De hecho, estudios realizados en células endoteliales muestran que el ritonavir, a la concentración de 11 µg/ml, produce una reducción significativa de la viabilidad celular16. Por otra parte, el tratamiento de macrófagos J774 con ritonavir produce un incremento significativo del número de células apoptóticas, que ya se aprecia a la concentración de 3,6 µg/ml17.
Diversos estudios han establecido que el ritonavir puede modificar la expresión de CD36 en monocitos y macrófagos, aunque algunos indicaban una reducción12 y otros un incremento13,14 en las concentraciones de este receptor. Las discrepancias en los resultados obtenidos llevaron a hipotetizar que el ritonavir produce efectos distintos según el estado de diferenciacos realizados en distintas condiciones experimentales o con células de distintas procedencias, por lo que, en primer lugar, nos propusimos evaluar el efecto de ritonavir sobre la misma línea celular (THP-1) con la utilización de monocitos no diferenciados o tras su diferenciación con PMA. Los resultados mostraron que ritonavir no ejercía un efecto signficativo en monocitos, mientras que en macrófagos diferenciados con PMA durante 24 h la expresión de CD36 en la superfície celular se incrementaba de forma significativa a la concentración más alta de ritonavir (fig. 1B), al igual que las concentraciones de ARNm correspondientes (fig. 1C). Allred et al19 demostraron que la ausencia del receptor estrogénico a (ERa) favorece el incremento en la expresión de CD36 en los macrófagos de ratones tratados con ritonavir. Sin embargo, este mecanismo no parece explicar los distintos resultados hallados en monocitos y macrófagos, pues las células THP-1 no estimuladas no expresan ERa y sí lo expresan tras su diferenciación con ésteres de forbol20, por lo que los monocitos deberían ser más sensibles al ritonavir. Por otra parte, es bien conocido que los ésteres de forbol activan la proteincinasa C (PKC) y se ha propuesto que el incremento que el ritonavir produce sobre la expresión de CD36 está mediado por la activación de PKC. Es posible, pues, que la activación de la PKC producida por el PMA sea la causa, al menos en parte, de la mayor sensibilidad al ritonavir respecto a la inducción de CD36 que se observa tras la diferenciación por este agente.
Otro de los mecanismos propuestos para explicar los efectos de los inhibidores de proteasas sobre la expresión de CD36 involucra cambios en la expresión o actividad de PPARg. Así, según Serghides et al12, la reducción en la expresión de CD36 en monocitos podría deberse a un déficit en la señalización o activación del heterodímero PPARg-RXR. Por el contrario, Dressman et al13, en células mononucleares humanas tratadas con ritonavir en combinación con LDL agregadas, observaron un incremento del ARNm CD36 mediado por un incremento de PPARg producido vía PKC.
Nuestros resultados muestran que el tratamiento con ritonavir produce modificaciones en la expresión del ARNm de PPARg que son paralelas a las producidas sobre el ARNm y la proteína de CD36. Por tanto, resulta plausible que el incremento de la expresión de CD36 causado por el ritonavir esté mediado por la inducción de PPARg que se produce a las dosis más altas utilizadas. La inducción de PPARg explicaría también el incremento observado en el ARNm y la proteína correspondientes a ABCA1, ya que en macrófagos humanos los agonistas PPARg incrementan la expresión de ABCA121.
Se ha propuesto que el incremento de PPARg y CD36 producido en macrófagos por acción del ritonavir se debe a la inhibición del proteasoma por parte de este fármaco, lo que conduciría a una menor degradación de SREBP y, por tanto, a un incremento de la forma madura de estos factores de transcripción en macrófagos18. En este mismo sentido, Zhou et al17 observaron que el tratamiento de macrófagos J774 con diversos inhibidores de proteasas incrementa de forma significativa las concentraciones de las formas maduras, transcripcionalmente activas, de SREBP-1 y 2. Según nuestros resultados, el tratamiento con ritonavir no produce un incremento en la forma madura de SREBP-1 en extractos nucleares; al contrario, se observa una reducción transitoria en tratamientos cortos (6 h), que retorna a la expresión normal a las 24 h. Por lo tanto, no parece factible que el incremento de CD36 y PPARg en nuestro modelo celular se deba a una inhibición del proteasoma; de hecho, la inhibición del proteasoma parece requerir concentraciones muy elevadas de ritonavir, del orden de 50-100 µM17, muy por encima de las utilizadas en nuestro estudio.
Además del incremento en la expresión de CD36 y ABCA1, el tratamiento con ritonavir produce una notable reducción en las concentraciones de proteí na de SR-BI, efecto que no se había descrito anteriormente por otros autores. El mecanismo no parece estar relacionado con la activación de PPARg, ya que los agonistas PPARg producen un incremento en la expresión de SR-BI22,23. Además, en este caso, la reducción en las concentraciones de proteína no se acompaña de una inhibición de la expresión del ARNm correspondiente, lo que descartaría un mecanismo de tipo transcripcional.
El presente estudio se ha realizado en monocitos y macrófagos no expuestos a condiciones proaterogénicas, es decir, que no se han tratado con LDL modificadas. En estas condiciones los cambios producidos por el ritonavir en la expresión de CD36, ABCA1 y SR-BI no son suficientemente intensos para modificar de forma significativa la acumulación de colesterol, por lo que no se han determinado las concentraciones de esteroles intracelulares. Sin embargo, la utilización de ritonavir como parte del TARGA se asocia a dislipemia3, por lo que los monocitos circulantes de estos pacientes se hallan en un entorno proaterogénico. En estas condiciones, el incremento en la expresión de CD36 podría comportar una mayor captación de LDL modificadas, y la reducción de SR-BI una menor salida de colesterol hacia aceptores extracelulares como las HDL, lo que podría traducirse en la acumulación de colesterol en el macrófago y conducir a la formación de células espumosas. Sin embargo, el incremento en la expresión de ABCA1 podría dar lugar a una mayor salida de colesterol hacia apolipoproteínas aceptoras que compensara la mayor captación mediada por el aumento de CD36. Este efecto podría favorecerse por la reducción de SR-BI, ya que se ha propuesto que éste inhibe el eflujo de colesterol mediado por ABCA1 en macrófagos24.
En conclusión, nuestro estudio demuestra que en macrófagos THP-1 el tratamiento con ritonavir produce un incremento en la expresión de CD36 y ABCA1 posiblemente mediado por el aumento en la expresión de PPARg, y concomitantemente una reducción en la proteína SR-BI. Sin embargo, son necesarios más estudios, especialmente en células expuestas a condiciones proaterogénicas, para poder comprobar estos efectos y descifrar los mecanismos por los cuales el ritonavir puede inducir la formación de células espumosas y el desarrollo de aterosclerosis.
Agradecimientos
Agradecemos a Abbot la donación de ritonavir para realizar los estudios. Jordi Pou y Alba Rebollo son becarios de la Universidad de Barcelona y del FIS, respectivamente.