La dislipemia es uno de los factores desencadenantes del proceso aterosclerótico que afecta a diversas funciones de la pared vascular, entre ellas la función endotelial1-3. Las alteraciones de las funciones homeostáticas ejercidas por las células endoteliales o disfunción endotelial implican cambios en la regulación del tono vasomotor, del crecimiento y migración de las células del músculo liso, de la adhesión de leucocitos y de la función plaquetaria4-6. Todos estos cambios favorecen un proceso oxidativo e inflamatorio local que se asocia con la activación de ciertos genes y la liberación de múltiples mediadores que participan en el desarrollo y la progresión de la aterosclerosis7.
Los inhibidores de la 3-hidroxi-3-metil-glutaril coenzima A reductasa reducen las concentraciones de colesterol total y de colesterol unido a lipopro teínas de baja densidad (cLDL), y como consecuencia ejercen efectos beneficiosos sobre la progresión y la complicación del desarrollo aterosclerótico5,6,8-10. Además del efecto hipolipemiante, las estatinas ejercen una serie de acciones directas o mediadas por la reducción de la producción de los isoprenoides, que se han dado en llamar acciones pleiotrópicas. Los efectos pleiotrópicos de las estatinas in cluyen: la mejora de la disfunción endotelial, la reducción del proceso oxidativo e inflamatorio, acciones antitrombóticas y de estabilización de la placa de ateroma5,8-11. Todas estas acciones pueden contribuir a sus efectos beneficiosos sobre la enfermedad cardiovascular.
La familia de los receptores activados por proliferadores de peroxisomas (PPAR) está formada por 3 tipos: a, b/d y g que se expresan en numerosos tejidos incluido el sistema cardiovascular12. Estos receptores nucleares regulan la expresión génica de numerosos mediadores implicados en el metabolismo lipídico y glucídico. Diversos estudios realizados con agonistas de los PPARa y g (fibra tos y glitazonas, respectivamente) han mostra do que además de sus acciones metabólicas ejercen efectos antiinflamatorios y antioxidantes13-16. Los PPARb/d son los más ubicuos y desempeñan un papel importante en el metabolismo lipídico mediante su participación en la oxidación de ácidos grasos, fundamentalmente, en el músculo esquelético12. Por tanto, en cierta medida, los agonistas de los PPARa y g parecen ejercer ciertas acciones similares a las de las estatinas; por ello, se ha hipotetizado que la activación de estos receptores podría mediar algunas de las acciones de estos fármacos hipolipemiantes17-19. Aunque algunos estudios sugieren la participación de los PPARa en el efecto antiinflamatorio20 o el papel de los PPARg en la acción antioxidante de las estatinas21, no se conoce bien el efecto de las estatinas sobre la expresión de estos factores de transcripcion nuclear. Es más, no se conoce la posible modificación de la expresión vascular de los PPAR por aumento de las concentraciones de lípidos plasmáticos o su modificación durante el desarrollo aterosclerótico. Por ello, el objetivo del estudio fue evaluar el efecto de la dislipemia sobre la expresión vascular de los PPAR así como el efecto del tratamiento con una estatina sobre éstos. Para ello, se estudió el efecto de atorvastatina sobre la función endotelial y la lesión aterosclerótica, así como la expresión aórtica de los PPARa,b/d y g en conejos dislipémicos.
Material y método
El estudio se realizó en 16 conejos machos de la cepa New Zealand (Granja Cunicular San Bernardo, Navarra), con un peso corporal de alrededor de 2 kg. Los animales se mantuvieron en condiciones controladas de luz y oscuridad (L:O, 12:12) y temperatura (22 ± 2 °C), con libre acceso al agua de bebida y alimentados con una dieta que contenía un 1% de colesterol (Mucedola s.r.l., Milán, Italia) durante 10 semanas. La mitad de los animales recibieron atorvastatina (1 mg/kg/día) en la comida durante el mismo período. Un grupo de animales alimentados con una dieta estándar se utilizó como grupo control (n = 8). Todos los experimentos se aprobaron por el comité para el uso y el cuidado de animales de la Universidad Complutense, de acuerdo con el Real decreto 223/1988 sobre protección de los animales utilizados para la experimentación y otros fines científicos. Al final del período de evolución, se tomaron muestras de sangre mediante un catéter insertado en la arteria de la oreja de los conejos en tubos que contenían ácido etilenediamin-tetracético (EDTA; 107 mol/l). Después de recoger las muestras de sangre, se aisló la aorta en animales anestesiados (pentobarbital sódico, 25 mg/kg intravenoso [i.v.]) para la realización de estudios de reactividad vascular, estudios histológicos y la expresión génica.
Perfil lipídico
Las concentraciones plasmáticas de triglicéridos, colesterol total y de colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad (cHDL) se midieron mediante técnicas enzimáticas colorimétricas con kits comerciales (Spinreact; Gerona, España). La concentración de cLDL se calculó utilizando la fórmula de Friedewald (colesterol total-cHDL triglicéridos/5).
Función endotelial
Una vez aislada la aorta, se eliminó el tejido conectivo adherido a ella y se cortó transversalmente en anillos de 3-4 mm de longitud. Los anillos aórticos se colocaron en baños de órganos con una solución Krebs bicarbonatada a 37 °C y oxigenada (95% de O2 y 5% de CO2) con un pH fisiológico (7,4-7,6) y se conectaron a transductores de fuerza (modelo FT03, Grass) acoplados a un sistema computarizado (McLab modelo 8E, AD Instruments) para registrar los cambios en la tensión isométrica desarrollados. Los anillos se equilibraron durante un período de 60-90 min, durante el cual se cambió el buffer cada 15 min y se ajustó la tensión basal de los anillos a 2 g. Cuando la tensión isométrica fue estable, se iniciaron los experimentos y se obtuvo una respuesta contráctil de referencia a KCl (80 mmol/l). En anillos aórticos precontraídos con una dosis submáxima de fenilefrina (107 mol/l), se estudió la respuesta vasodilatadora dependiente de endotelio a la acetilcolina (109-105 mol/l) y la respuesta independiente de endotelio al nitroprusiato sódico (1010-106 mol/l).
Análisis morfométrico
Se utilizaron segmentos de aorta torácica que se fijaron en etanol al 70% y posteriormente se incluyeron en parafina formando bloques para su tallado en secciones de 4 micras de grosor con un microtomo de rotación (Leitz 1512, IMEB INC, Chicago, EE.UU.). Los cortes se tiñeron con hematoxilina/eosina y tricrómico de Masson. Las medidas del área del vaso, el área de la luz y el área de la media se realizan con un analizador de imagen LEICA Q 500IW (Leica, España); para ello se captaron las imágenes con una videocámara conectada a un microscopio, se digitalizaron y se valoraron las diferentes áreas5. Para la determinación del área de la luz, se midió el área delimitada por la lámina elástica interna y para el área del vaso se utilizó el área contenida por la lámina elástica externa. Se introdujo el factor de corrección L2/4p, donde L es la longitud de la lámina interna o externa para evitar errores de cálculo en el área de la luz y del vaso debido a que los segmentos aórticos pueden deformarse durante su manejo.
Aislamiento de ARN
Las aortas torácicas congeladas se pulverizaron con un mortero de acero inoxidable y siempre en contacto con nitrógeno líquido. Inmediatamente después, se pesaron 100 mg de tejido pulverizado y se homogeneizaron con 1 ml de tri-reagent (Molecular Research Center Inc. Cincinnati, OH, EE.UU.) utilizando un homogeinizador Potter de vidrio-teflón. El aislamiento de ARN se llevó a cabo según la metodología de Chomczynski22. Posteriormente el ARN se cuantificó midiendo la densidad óptica a 260 nm utilizando un espectofotómetro (BioPhotometer, Eppendorf, Germany). El ARN se conservó a 80 °C hasta su utilización.
Reacción de la transcriptasa inversa
Se utilizaron 2 µg de ARN total para la obtención de ADN complementario (ADNc) mediante transcripción inversa utilizando los reactivos aportados por el kit comercial Rteasy Reverse Transcription kit (Maxim Biotech. So. San Francisco, CA, EE.UU.). Siguiendo el protocolo del kit, se completó la muestra con agua estéril hasta un volumen final de 14,5 µl y se realizó una incubación previa de la muestra con 4 µl de oligo (dT) (50 µM) utilizados como cebadores a 70 °C durante 5 min; transcurrido este tiempo se enfrió la muestra en hielo. Posteriormente se añadió una mezcla de reacción compuesta por 10 µl de buffer RT 5X (Tris HCl 250 mM; pH = 8,3, KCl 375 mM, MgCl2 15 mM y DTT 50 mM), 0,5 µl de inhibidor de ARNasa (130U/µl), 20 µl de dNTPs (1 mM) y 1 µl de enzima retrotranscriptasa MMLV (virus de leucemia murina de Moloney) durante 1 h a 37 °C. Seguidamente, con el fin de inactivar la reacción, se calentó la muestra a 95 °C durante 10 min y, transcurrido este tiempo, se reenfrió a 4 °C en hielo. La mezcla se completó con 50 µl de agua libre de ADNasa. El ADNc sintetizado se almacenó a 20 °C hasta su utilización.
Análisis por RT-PCR cuantitativa (Real Time)
Para cuantificar las concentraciones de ARN mensajero se realizaron reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativas y en tiempo real utilizando un termociclador Real Time PCR Smart Cycler (Cepheid, Sunnyvale, California, EE.UU.). Para este análisis se utilizaron sondas TaqMan modificadas con una molécula fluorescente en el extremo 5' y con un quencher en el 3'. Los siguientes cebadores y sondas fueron sintetizados por Metabion (Munich, Alemania); PPARa: 5'- GAGTTCCTCCAGGAAATGG-3' (sentido), 5'-CACGGAGCCATCTGATCC-3' (antisentido), 5'-Cy3- TGAGGACAGCTCTGGAAGCTTCAG-BHQ2-3' (sonda); PPARb/d: 5'-CGAGAAGTGCGAGCGGAG-3' (sentido), 5'-GTTGTGCGACATGCCCA-3' (antisentido), 5'-Fam-ATCCAGAAGAAGAACCGCAACAAGTGCC-TMR-3' (sonda); PPARg: 5'-CGGGATCGGCTCCGTGGATC-3' (sentido), 5'-CTCTTGCGAATGGAAGGTCT-3' (antisentido), 5'-Fam- CCTTTCACCACCGTGGACTTCTCCAGCA-BHQ1-3' (sonda); GADPH:5'-GTCATCCCCGAGCTGAAC-3' (sentido), 5'-TCACCACCTTCTTG ATGTCG-3' (antisentido), 5'-TexasRed-GGTCGTGGACCTGA CCTGCCGCC-BHQ2-3' (sonda). En las condiciones de anillamiento la sonda hibridó con el ADN molde. En la extensión de los cebadores, la actividad exonucleasa de la Taq ADN polimerasa degrada la sonda resultando en la emisión de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia se corresponde con la cantidad de producto amplificado. Los valores obtenidos se normalizaron con la expresión de la GAPDH y se analizaron23 mediante el método de 2nnCT.
Análisis estadístico
La respuesta relajante se expresó como el porcentaje de la reducción de la tensión en el anillo precontraído con fenilefrina. Los resultados se expresaron como la media ± EEM de los anillos de 8 conejos. Las curvas dosis-respuesta se compararon mediante un análisis de la varianza múltiple para medidas repetidas con el programa estadístico SPSS 14.0 (Statoft Inc., Tulsa, Oklahoma, EE.UU.). El resto de los datos se analizaron mediante un análisis de la varianza de una sola vía (ANOVA), seguido del test Newman-Keuls si había diferencias. Las diferencias se consideraron significativas cuando p < 0,05.
Resultados
El incremento de las concentraciones de colesterol plasmáticas observado en los conejos alimentados con una dieta enriquecida con colesterol se debió, fundamentalmente, a un aumento de los valores de cLDL (200 veces), aunque también se observó un incremento menor de las de cHDL (4 veces) (tabla 1). En consecuencia, los animales alimentados con una dieta enriquecida con colesterol presentaron un índice aterogénico (relación colesterol total/cHDL) mayor que los controles (14,8 ± 1,1 frente a 1,5 ± 0,1; p < 0,05). Asimismo, se observó un ligero incremento de las concentraciones de triglicéridos (2 veces) (tabla 1). El tratamiento concomitante con atorvastatina atenuó significativamente el incremento de las concentraciones plasmáticas de colesterol total (30%), aunque no fue capaz de normalizarlas. Esta reducción de las concentraciones de colesterol parecen deberse, fundamentalmente, a una reducción de la concentración de cLDL ( 26%) ya que no se modificaron los valores de cHDL de manera significativa. En consecuencia, el índice aterogénico mejoró con la administración de atorvastatina (10,8 ± 1,6 frente 14,8 ± 1,1, p < 0,05). El tratamiento con atorvastatina previno también el incremento de los valores de triglicéridos (tabla 1). Al final del experimento no se observaron diferencias significativas en el peso corporal entre los diferentes grupos (datos no incluidos).
La respuesta relajante a la acetilcolina fue menor en los anillos aórticos de los conejos dislipémicos que en los anillos de los conejos alimentados con una dieta control (fig. 1). La administración de la atorvastatina previno esta reducción (fig. 1). No se observaron diferencias en la respuesta relajante al nitroprusiato sódico entre los anillos de conejo dislipémicos y los anillos del grupo control. Asimismo, el tratamiento con atorvastatina no modificó dicha respuesta (datos no incluidos).
Figura 1. Relajación inducida por la acetilcolina (109-105 mol/l) en anillos de aorta precontraídos con una concentración submáxima (106 mol/l) de fenilefrina (FE) de conejos control (CC), conejos alimentados con una dieta enriquecida con colesterol (DL) y conejos alimentados con una dieta enriquecida con colesterol y tratados con atorvastatina (1 mg/kg/día) (DL + ATV). ap < 0,05 frente a CC. bp < 0,05 frente a DL.
Como se observa en la tabla 2 y en la figura 2, la luz del vaso fue menor en las aortas de los conejos dislipémicos que en las aortas de los animales del grupo control, debido a que aproximadamente el 30% del área contenida en la lámina elástica interna está ocupado por la lesión aterosclerótica. No se observaron diferencias en el área del vaso, ni en el área de la media entre los grupos estudiados, por lo que la relación media/luz fue mayor en las aortas de los conejos dislipémicos que en los controles (tabla 2). El tratamiento con atorvastatina disminuyó el tamaño de la lesión y, en consecuencia, previno la reducción de la luz en los conejos dislipémicos (fig. 2 y tabla 2).
Figura 2. Microfotografías representativas de la sección transversal de la aorta. A) Conejos control. B) Conejos alimentados con una dieta enriquecida con colesterol. C) Conejos alimentados con una dieta enriquecida con colesterol y tratados con atorvastatina (1 mg/kg/día). Aumento original *12,5.
Los conejos dislipémicos presentaron una reducción significativa de la expresión aórtica de los PPARa y g en comparación con los animales controles (fig. 3A y 3B). La administración de atorvastatina previno esta reducción. La expresión vascular de los PPARb/d no se modificó ni por la dieta con alto contenido en colesterol ni por el tratamiento con atorvastatina (fig. 3C).
Figura 3. Expresión génica de PPARa (A), PPARg (B) y PPARb/d (C) por RT-PCR en tiempo real en aortas de conejos control (CC), conejos alimentados con una dieta enriquecida con colesterol (DL) y conejos alimentados con una dieta enriquecida con colesterol y tratados con atorvastatina (1 mg/kg/día) (DL + ATV). ap < 0,05 frente a CC; bp < 0,05 frente a DL.
Discusión
Los datos del estudio muestran que la dislipemia inducida en conejos por una dieta con un 1% de colesterol se acompaña de disfunción endotelial y del engrosamiento de la íntima de la aorta, además de una reducción de la expresión vascular de los PPARa y de los PPARg. Asimismo, los resultados muestran que la administración de atorvastatina no sólo mejora las alteraciones funcionales y estructurales vasculares observadas en los conejos dislipémicos, sino que también normaliza la expresión vascular de los PPARa y de los PPARg, incluso en presencia de concentraciones elevadas de colesterol. Teniendo en cuenta los efectos descritos para los agonistas de los PPAR, estos datos podrían sugerir que un aumento de la expresión PPARa y g podría participar en los efectos vasculares de la atorvastatina.
En estudios previos se ha demostrado que la administración de una dieta con un 1% de colesterol en conejos produce cambios en el perfil lipídico que se caracterizan por un aumento de las concentraciones de colesterol total, de cLDL y de triglicéridos5,6. Estas alteraciones se acompañan de una reducción de la expresión aórtica de los PPARa y de los PPARg. Estos datos confirman un estudio previamente publicado en el que se observó que la hipercolesterolemia reducía tanto la expresión vascular como la actividad de estos factores en conejos21. De manera similar, la dislipemia disminuyó la expresión aórtica de los PPARa y g en ratones knockout para apo E estimulados con angiotensina II24 y en ratones knockout para los receptores de LDL y de leptina alimentados con una dieta con alto contenido en grasa25. Por tanto, estos datos sugieren que un aumento de las concentraciones de lípidos plasmáticos pueden regular negativamente la expresión génica de los PPAR. El mecanismo o los mecanismos implicados en esta regulación no se han establecido bien, aunque cabría sugerir que la acumulación intravascular exagerada de lípidos asociada con los cambios del perfil lipídico circulante observada en los conejos dislipémicos5 podría modificar algunos de los mecanismos o factores que controlan la expresión de los PPAR.
Numerosos estudios han sugerido el papel modulador de los PPARa y de los PPARg en el desarrollo de la lesión aterosclerótica, demostrando que la administración de sus agonistas inhibe diferentes procesos implicados en la progresión de la placa como son: la expresión de moléculas de adhesión, el reclutamiento de leucocitos, la formación de macrófagos y la producción de citocinas, entre otras12-16. Asimismo, los agonistas de los PPAR mejoran la estabilidad y reducen la trombogeneidad de las placas mediante el aumento de la apoptosis de los macrófagos y la reducción de la expresión del factor tisular y de las metaloproteinasas12,13,16. Estos procesos son consecuencia, al menos en parte, de la capacidad que tienen estos agentes de inhibir la activación del factor nuclear kB24. Una mejora de la función endotelial podría ser otro mecanismo implicado en la acción antiaterosclerótica de los PPARa y g, ya que sus agonistas estimulan la producción de NO26-28 y, en consecuencia, la activación de todos los efectos protectores que ejerce este factor endotelial en la pared vascular29. Por tanto, se podría sugerir que en los conejos dislipémicos, la reducción de la expresión vascular de estos factores nucleares, y en consecuencia de sus efectos a este nivel, podría favorecer el desarrollo aterosclerótico producido por una dieta con alto contenido en colesterol. En este sentido se ha observado que una reducción de la expresión vascular de los PPARa y de los PPARg se acompaña del engrosamiento de la íntima en diferentes modelos experimentales21,24,25.
La observación de que la mejora de la lesión aterosclerótica y de la disfunción endotelial producida por la administración de atorvastatina se acompaña de un aumento de la expresión vascular de los PPARa y de los PPARg, refuerza la hipótesis anterior de que una disminución de los PPAR podría favorecer el desarrollo aterosclerótico en conejos dislipémicos. Asimismo, esta observación apoya el posible papel modulador de los lípidos intravasculares sobre la expresión génica de los PPARa y g, ya que, aunque atorvastatina no normaliza las concentraciones plasmáticas de colesterol, es capaz de reducir de manera importante el contenido de lípidos intra y extracelulares en el ámbito vascular5. Más aun, estos datos podrían sugerir la participación de los PPARa y g en los efectos antiaterogénicos ejercidos por la atorvastatina. En este sentido diversos estudios han sugerido que el efecto hipolipemiante y antiinflamatorio de las estatinas podría ser mediado, en parte, por la activación de los PPARa17-19. El posible mecanismo implicado en este proceso no está bien establecido, aunque se podría sugerir la participación de los efectos pleitrópicos de las estatinas. Estos fármacos, además de inhibir la síntesis de colesterol, presentan acciones mediadas por la inhibición de la síntesis de importantes intermediarios isoprenoides, fundamentales para el anclaje a la membrana plasmática y el funcionamiento de una gran cantidad de proteínas implicadas en numerosos procesos celulares30. Estas acciones pleitrópicas desempeñan un papel fundamental en la reducción de la lesión aterosclerótica y la mejora de la disfunción endotelial observada al aumentar la producción de NO, e inhibir la producción de las especies reactivas de oxígeno Tg, de citocinas, la expresión de moléculas de adhesión, el reclutamiento de leucocitos y la formación de macrófagos5,8-11,30. Todos estos efectos son consecuencia de la modulación de diferentes factores de transcripción como el NFkB31,32 y, finalmente, de toda una serie de vías de señalización que podrían regular también la expresión de los PPAR. En este sentido, se ha observado que la atorvastatina previene la reducción de la expresión cardíaca de los PPAR al inhibir la activación del NFkB en ratas con hipertrofia cardíaca33.
A diferencia de los PPARa y de los PPARg, cuyo papel protector en el desarrollo aterosclerótico se ha demostrado con el uso de sus agonistas, la participación de los PPARb/d en éste es menos conocido16. De todos los PPAR, los de tipo b/d son los más ubicuos y tienen un papel importante en el metabolismo lipídico. La administración de sus agonistas se asocia con un aumento de las concentraciones de cHDL y una reducción de las de triglicéridos y cLDL, por lo que se ha sugerido que podrían ser una diana en el tratamiento de la dislipemia34. A pesar de estas observaciones, en el presente estudio no se han observado cambios en la expresión vascular de este factor ni en los animales ateroscleróticos, ni en los tratados con atorvastatina, lo que sugiere que la expresión de este factor no está modulada por cambios en el perfil lipídico.
En resumen, los resultados del estudio muestran que el desarrollo aterosclerótico y la disfunción endotelial observada en los conejos dislipémicos se asocian a una reducción de la expresión vascular de los PPARa y los PPARg, lo que sugiere que una reducción de la actividad de éstos podría favorecer el desarrollo aterosclerótico inducido por una dieta enriquecida con colesterol. Asimismo, los resultados muestran que el efecto de la atorvastatina sobre la reducción de la lesión y la mejora de la función endotelial se acompaña de un aumento de la expresión de los PPARa y g, lo que sugiere que el papel protector de la atorvastatina en la pared vascular podría ser mediado, en parte, por una activación de estos factores. Finalmente, los resultados demuestran que la hipercolesterolemia ejerce un efecto diferencial sobre la expresión vascular de los PPAR, y los PPAR b/d son los menos sensibles a ésta.
Agradecimientos
Agradecemos la asistencia técnica de Antonio Carmona.