Actividad in vitro de voriconazol y otros tres antifúngicos frente a dermatofitos

Introducción. En los últimos años se ha observado un incremento en las infecciones por hongos dermatofitos, lo que ha llevado a la investigación de nuevas preparaciones antifúngicas que sean eficaces frente a estos hongos. Métodos. Hemos comparado la actividad in vitro de un nuevo antifúngico, voriconazol, con otros tres antifúngicos, itraconazol, fluconazol y terbinafina, frente a 120 dermatofitos pertenecientes a cuatro especies (Trichophyton mentagrophytes [n = 61]; Microsporum canis [n = 34]; M. gypseum [n = 13], y T. rubrum [n = 12]). El método utilizado fue el de microdilución en medio líquido siguiendo las recomendaciones del documento M38-P propuesto por el National Committee Laboratory Standards con algunas modificaciones. Resultados. En general, terbinafina fue el antifúngico más activo (CIM90 ≤ 0,03 mg/ml) seguido por voriconazol (CIM90, 0,25 μg/ml) y por itraconazol (CIM90, 0,5 μg/ml). Fluconazol fue el agente menos activo. Voriconazol e itraconazol mostraron las CIM más bajas frente a M. canis, 0,12 y 0,25 μg/ml, respectivamente. Conclusiones. En función de estos resultados puede decirse que voriconazol es un antifúngico con una excelente actividad frente a dermatofitos.

Introduction. The increase in infections due to dermatophytes in recent years led us to study the effectiveness of new antifungal formulations against these microorganisms. Methods. The in vitro activity of a new antifungal agent, voriconazole, was compared with three other antifungal agents, itraconazole, fluconazole and terbinafine, against 120 dermatophytes belonging to four species (61 Trichophyton mentagrophytes, 34 Microsporum canis, 13 M. gypseum and 12 T. rubrum). A broth microdilution method was used following the recommendations of the NCCLS document M38-P with some modifications. Results. Terbinafine was the most active agent against the dermatophytes studied (MIC90 ≤ 0.03 mg/ml), followed by voriconazole (MIC90, 0.25 μg/ml) and itraconazole (MIC90, 0.5 μg/ml). Fluconazole was the least active antifungal agent. The most susceptible species was M. canis. Conclusions. Voriconazole was found to have effective activity against dermatophytes.

Introducción

Los dermatofitos son un grupo de hongos que se caracterizan por su capacidad para invadir los tejidos queratinizados (piel, pelo, uñas), tanto en el hombre como en los animales^1-4, causando infecciones superficiales que, por lo general, responden bien con tratamiento antifúngico local. En las últimas décadas, se ha observado un aumento de pacientes inmunodeprimidos en los que la dermatofitosis se manifiesta de forma más grave y con sintomatología atípica, necesitando para su tratamiento el empleo de antifúngicos sistémicos^5,6.

Los agentes antifúngicos más utilizados en el tratamiento de estas infecciones son la terbinafina y el itraconazol^7,8. En los últimos años han aparecido nuevos agentes antifúngicos con buena actividad frente a gran variedad de hongos, uno de ellos es el voriconazol, que se caracteriza por ser un triazol con estructura similar al fluconazol y excelente actividad frente a levaduras, hongos dimórficos y hongos filamentosos oportunistas^9-13.

El objetivo de este estudio fue comparar la actividad in vitro de este nuevo antifúngico, voriconazol, frente a otros tres antifúngicos de actividad ya conocida, fluconazol, itraconazol y terbinafina utilizando el método de microdilución en caldo propuesto por el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) (M38-P) con algunas modificaciones¹⁴.

Métodos

Aislamientos

Estudiamos un total de 120 dermatofitos, que pertenecían a especies que comúnmente causan infecciones en la práctica clínica. Estas especies fueron: Trichophyton mentagrophytes (n = 61), Microsporum canis (n = 34), M. gypseum (n = 13) y T. rubrum (n = 12). Las cepas procedían de aislamientos clínicos obtenidos tanto en el Hospital Universitario de Valme de Sevilla como en el Hospital Universitario de La Fe de Valencia. La identificación de las especies se realizó siguiendo las características tanto microscópicas como macroscópicas de los hongos.

Medio

El medio utilizado fue el RPMI-1640 (GIBCO BRL, Barcelona) con L-glutamina y sin bicarbonato sódico tamponado con 0,165 MOPS (Sigma, Madrid).

Antifúngicos

Los antifúngicos se obtuvieron a través de los fabricantes: fluconazol y voriconazol (Pfizer, Central Research Foundation, Beerse, Belgium), itraconazol (Janssen Research Foundation Beerse, Bélgica) y terbinafina (Novartis, Basel, Suecia). Las soluciones madres de todos los antifúngicos se prepararon en dimetil sulfóxido al 100% a la concentración de 1.600 μg/ml exceptuando el fluconazol, que se diluyó en agua destilada estéril a una concentración inicial de 6.400 μg/ml. Estas soluciones madres se congelaron a ­20 °C hasta que fueran necesarias. Como describe el documento M38-P del NCCLS¹⁴, la solución madre se prepara a una concentración 100 veces superior a la concentración final deseada y seguida de una dilución 1:50 en medio RPMI para que la concentración del antifúngico en los tubos sea dos veces mayor que a la concentración final en el pocillo.

Método

El método utilizado fue el de la microdilución en caldo según las normas del documento M38-P del NCCLS¹⁴, siguiendo algunas modificaciones propuestas por otros autores^15-17.

Preparación del inóculo

El inóculo inicial se realizó a partir de cultivos puros, provenientes en placas de agar patata dextrosa (APD), incubadas durante 7 a 15 días y a 28 °C (todas las cepas estudiadas presentaron esporulación en este medio). Las colonias maduras fueron cubiertas con aproximadamente 10 ml de solución salina estéril (0,85%), raspando la superficie con la punta de una pipeta Pasteur. La mezcla resultante de conidias e hifas, se transfirió a tubos estériles dejándolos reposar a temperatura ambiente durante 15 a 20 min. El sobrenadante resultante se mezcló en vórtex durante unos 15 s, midiendo su turbidez con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 530 nm y a una transmitancia ajustada al 65-70%. Cada suspensión se diluyó 1:50 en RPMI obteniendo dos veces el inóculo final en cada pocillo. El inóculo correspondiente a las 120 cepas (cuatro especies) (tabla 1) se cuantificó tomando 0,01 ml de una dilución 1:100 del inóculo previamente ajustado sobre una placa de APD. Las placas fueron incubadas a 28 °C y observadas diariamente. Cuando el crecimiento era evidente, las colonias se contaron expresándose como unidades formadoras de colonias (UFC)/ml.

Procedimiento

El ensayo se realizó en placas estériles de microtitulación con pocillos en forma de "U" (Soria-Greiner, Madrid). Se tomaron alícuotas de 100 μl del antifúngico, diluido dos veces y se inoculó en la microplaca mediante una pipeta multicanal. A continuación se añadieron 100 μl del inóculo diluido en cada uno de los pocillos para obtener la concentración final de los antifúngicos. Los intervalos de concentraciones finales de los antifúngicos fueron de 0,12-64 μg/ml para fluconazol y de 0,03-16 μg/ml para el resto. En cada aislamiento se incluyó un control de crecimiento y un control de esterilidad. Las microplacas fueron incubadas a 28 °C y leídas visualmente con la ayuda de un espejo a los 4 días de incubación. Para los azoles, la concentración inhibitoria mínima (CIM) fue la concentración más baja del antifúngico que mostró una inhibición evidente del crecimiento (aproximadamente una inhibición del crecimiento del 50% comparada con el control de crecimiento). Para la terbinafina la CIM fue la concentración más baja que mostró una inhibición del 100% del crecimiento.

Resultados

Todas las especies estudiadas presentaron un crecimiento evidente a los 4 días de incubación.

En la tabla 1 se muestra el rango del tamaño del inóculo obtenido para las cuatro especies de dermatofitos ajustado a un 65-70% de transmitancia.

En la tabla 2 está representada la actividad in vitro de los cuatro antifúngicos estudiados frente a 120 cepas de dermatofitos. Para todos los aislamientos, los rangos de las CIM oscilaron entre 0,06-2 μg/ml para voriconazol, 0,25-≥ 64 μg/ml para fluconazol, 0,06-2 μg/ml para itraconazol y de ≤ 0,03 μg/ml para la terbinafina. En general, la terbinafina fue el agente antifúngico más activo, con CIM₅₀/CIM₉₀ ≤ 0,03/≤ 0,03 μg/ml, seguida por el voriconazol, con CIM₅₀/CIM₉₀ de 0,06/0,25 μg/ml y por el itraconazol, con CIM₅₀/CIM₉₀ de 0,25/0,5 μg/ml. El antifúngico que presentó menor actividad fue fluconazol, con CIM₅₀/CIM₉₀ 16/≥ 64 μg/ml.

Frente a todas las especies ensayadas terbinafina presentó la misma CIM₉₀ (≤ 0,03 μg/ml). Voriconazol presentó las CIM₉₀ más elevadas para las especies T. mentagrophytes y M. gypseum. La CIM₉₀ para voriconazol (1 μg/ml), itraconazol (0,5 μg/ml) y fluconazol (≥ 64 μg/ml) fue igual para ambas especies. Las CIM₉₀ para voriconazol y fluconazol frente a T. rubrum fueron un poco más bajas (0,25 y 32 μg/ml, respectivamente) e igual para itraconazol (0,5 μg/ml). M. canis fue la especie que se mostró más sensible con CIM₉₀ de 0,12 μg/ml para voriconazol y de 0,25 μg/ml para itraconazol.

Discusión

El tratamiento de las infecciones causadas por dermatofitos ha ido evolucionando en las últimas décadas. Ello se debe, no sólo a la aparición de posibles resistencias frente a alguno de los antifúngicos ya conocidos¹⁸, lo cual conllevaría secundariamente al aumento en la incidencia de estas infecciones, sino también a la aparición de procesos más graves y con manifestaciones clínicas atípicas en pacientes sometidos a alguna inmunodepresión. Para estos casos es necesario el empleo de antifúngicos más potentes. Terbinafina e itraconazol han demostrado una excelente actividad en aquellos procesos en los que por su gravedad necesitaron ser tratados de forma más agresiva^7,8. En los últimos años se han realizado numerosos estudios en los que se observa la excelente actividad de voriconazol; sin embargo, pocos son los estudios en los que se ha probado su actividad in vitro frente a hongos dermatofitos^15,19,20.

Actualmente, no existe método estandarizado para determinar la sensibilidad antifúngica frente dermatofitos. Nosotros hemos tomado como base el documento del NCCLS¹⁴ para los hongos filamentosos, introduciendo una serie de modificaciones propuestas por otros autores en previos estudios de sensibilidad de estos hongos estos mismos antifúngicos^15,16. Estas modificaciones consisten en la disminución de la temperatura de incubación, de 35 a 28 °C, así como la prolongación en el tiempo de incubación, de 24-72 h de 3 a 4 días, dependiendo de la especie. Norris et al¹⁷ y Jessup et al²¹ han empleado similares condiciones de tiempo y temperatura. El medio empleado para la preparación del inóculo ha sido APD, siguiendo las publicaciones de otros investigadores^15,16, a diferencia de Norris et al¹⁷ y Jessup et al²¹ que recomiendan para la óptima formación de conidias el medio agar outmeal ceral y agar RPMI-1640, respectivamente. La preparación del inóculo se realizó, al igual que otros autores²², siguiendo las indicaciones del documento M38-P propuesto por el NCCLS, ajustándolo a una transmitancia del 65-70%^15,16 a diferencia de otros autores en los que se ajustó a una transmitancia del 95%¹⁹. Utilizando esta transmitancia se han obtenido inóculos comprendidos entre 3 x 10⁴ y 2 x 10⁶ UFC/ml para todas las especies estudiadas, coincidiendo con los resultados de concordancia y recuento de colonias de Fernández-Torres et al^15,16. El inóculo estaba compuesto por una mezcla de conidias y fragmentos de hifas siguiendo el trabajo de Fernández- Torres et al^15,16, así como el de Manavathu et al²³ que demostró que el tipo de inóculo para Aspergillus fumigatus no tenía especial influencia sobre las CIM. En este sentido, serían necesarios nuevos estudios para evaluar la influencia del tipo de inóculo en el estudio de la sensibilidad de hongos dermatofitos. Estas diferencias en la metodología utilizada hace difícil el poder comparar nuestros resultados con otros estudios realizados por otros autores. A pesar de esto, todos coinciden^16,19 en que la terbinafina es el antifúngico más activo frente a los dermatofitos, con CIM inferiores a 0,06 μg/ml. En nuestro estudio, voriconazol ha demostrado una excelente actividad in vitro con CIM₉₀ de 0,25 μg/ml, siendo más activo que itraconazol con CIM₉₀ de 0,5 μg/ml. Estos resultados difieren un poco de los observados por Perea et al¹⁹ y Wildfeuer et al²⁰ donde el itraconazol mostró ser más activo que el voriconazol. Fluconazol, por el contrario, mostró una baja actividad frente a todas las especies estudiadas con CIM₉₀ ≥ 64 μg/ml en coincidencia con lo publicado por otros investigadores¹⁹.

Los resultados de los distintos estudios realizados varían dependiendo de la especie estudiada. Nosotros observamos que M. canis fue la especie más sensible tanto para el voriconazol (CIM₉₀ 0,12 μg/ml) como para itraconazol (CIM₉₀, 0,25 μg/ml) mientras que Wildfeuer et al²⁰ demuestran que M. canis fue la especie más resistente. En el caso de T. mentagrophytes también se observaron discrepancias con lo mostrado por otros autores. La CIM₉₀ de itraconazol fue de 1 μg/ml, mientras que Perea et al¹⁹ y Wildfeuer et al²⁰ mostraron una CIM₉₀ de 0,12 μg/ml.

Aunque existan en la literatura especializada pocos estudios que valoren la actividad antifúngica del voriconazol frente a los dermatofitos, todos coinciden en que este antifúngico presenta una excelente actividad tanto in vitro como in vivo, por lo que podría ser el mejor antifúngico en el tratamiento de las infecciones producidas por estos hongos, sobre todo en el caso de cuadros graves donde es necesario administrar el antifúngico por vía sistémica. Aun así, estos resultados deben tomarse con cautela, siendo necesario obtener más datos clínicos que confirmen si esta buena actividad in vitro del voriconazol es predictivo de una buena respuesta clínica.