Caracterización genética de bacterias endofíticas de arroz (Oryza sativa L.) con actividad antimicrobiana contra Burkholderia glumae

Resumen

El objetivo del presente estudio fue aislar y seleccionar bacterias endofíticas de arroz capaces de inhibir al fitopatógeno Burkholderia glumae THT, así como caracterizarlas por su genética y bioquímica. También se buscó caracterizar la diversidad genética y los factores de virulencia presentes en cepas de B. glumae y de Burkholderia gladioli, otro patógeno de arroz, aisladas de campo. Se colectaron plantas de arroz en 4 departamentos del norte de Perú, y tras la desinfección de tejidos se aislaron bacterias endofíticas por cultivo en agar soya tripticasa (30 °C; 48 h) y en medio selectivo (pH 4,5; 41 °C; 72 h). Se evaluó la actividad antimicrobiana frente a B. glumae THT, la producción de sideróforos y la resistencia a la toxoflavina, toxina producida por este agente. La identificación molecular se realizó mediante BOX-PCR y secuenciación del gen 16S ARNr. Además, se determinó la producción de enzimas extracelulares y se efectuaron ensayos de motilidad y sensibilidad/resistencia a bactericidas. Se aislaron 189 bacterias endofíticas, de las cuales solo 9 presentaron actividad antimicrobiana contra B. glumae THT, sobresaliendo Burkholderia vietnamiensis TUR04-01, B. vietnamiensis TUR04-03 y Bacillus aryabhattai AMH12-02. Estas cepas produjeron sideróforos y al menos el 55,5% fueron resistentes a la toxoflavina. Por otro lado, 17 de las cepas de B. glumae y B. gladioli aisladas se agruparon en 9 perfiles BOX-PCR, 16 de ellas presentaron similitud con B. glumae LMG2196^T (100%) y una con B. gladioli NBRC13700^T (99,86%). Hubo elevada diversidad de acuerdo al origen geográfico y se encontraron factores de virulencia. En conclusión, se hallaron cepas del género Bacillus y Burkholderia que podrían ser agentes de biocontrol contra B. glumae.

Abstract

The aim of the present study was to isolate, select and characterize endophytic bacteria in rice inhibiting Burkholderia glumae THT as well as to characterize the genetic diversity and virulence factors in strains of B. glumae and Burkholderia gladioli of rice. Rice plants were collected in 4 departments from the northern region of Peru, isolating endophytic bacteria, after tissue sterilization, at 30 °C (48 h) in Trypticase Soy Agar (TSA), evaluating the antimicrobial activity against B. glumae THT, production of siderophores, resistance of toxoflavine and partial sequencing of the 16S rRNA gene. Furthermore, B. glumae and B. gladioli were isolated in selective medium (pH 4.5) at 41 °C/72 h. Molecular identification was performed using BOX-PCR and sequencing of the 16S rRNA gene, in addition to the production of extracellular enzymes, motility tests and sensitivity/resistance to bactericides. One hundred and eighty nine (189) endophytic bacteria were isolated, and only 9 strains showed antimicrobial activity against B. glumae THT, highlighting Burkholderia vietnamiensis TUR04-01, B. vietnamiensis TUR04-03 and Bacillus aryabhattai AMH12-02. The strains produced siderophores and at least 55.5% were resistant to toxoflavin. Additionally, 17 strains were grouped into 9 BOX-PCR profiles, where 16 had similarity with B. glumae LMG2196^T (100%) and 1 with B. gladioli NBRC 13700^T (99.86%). High diversity was found according to geographical origin and virulence factors. In conclusion, strains of the genus Bacillus and Burkholderia are potential biocontrol agents against B. glumae.

Introducción

El arroz constituye la fuente de hidratos de carbono más importante para la tercera parte de la población mundial; sin embargo, obtener una óptima producción implica la aplicación de fertilizantes, así como el control de plagas y enfermedades¹. Burkholderia glumae y Burkholderia gladioli son considerados los agentes etiológicos del añublo bacterial de la panícula de arroz (ABPA)^26,34. Esta enfermedad se manifiesta en la etapa de floración y provoca infertilidad, con decoloración y manchado de la gluma en desarrollo debido a la producción de toxoflavina³⁶. La enfermedad ha sido reportada por primera vez en Perú en 2013²⁴.

El agricultor arrocero no posee un método de control efectivo para el tratamiento del ABPA²⁶: a pesar del empleo intensivo de pesticidas, el 50% de la producción puede perderse debido a esta enfermedad⁴². Hasta el momento el único agente químico capaz de controlar la enfermedad es el ácido oxolínico²⁶; sin embargo, dicho compuesto está prohibido por las autoridades sanitarias porque constituye un riesgo debido a la generación de resistencia y a la presencia de cepas naturalmente resistentes a este agente químico²⁸. A la fecha las estrategias de prevención son las más empleadas.

Los microorganismos asociados al arroz han coevolucionado con su hospedero en virtud de su capacidad para reducir enfermedades en el nicho ecológico compartido empleando diferentes estrategias²⁶. Bajo esa perspectiva, el control biológico se ha mostrado prometedor^6,11. Estrategias basadas en mecanismos biológicos como el quorum quenching²⁰, la resistencia sistémica inducida¹² y la producción de metabolitos antimicrobianos⁵⁰ constituyen las más prometedoras. Shrestha et al.⁴⁹ reportaron que cepas de Bacillus amyloliquefaciens fueron capaces de inhibir el crecimiento de B. glumae 336 g-1. La búsqueda de microorganismos que comparten el hábitat con B. glumae durante el proceso de desarrollo de la enfermedad se considera de interés, ya que estos podrían servir para controlar el patógeno.

Contar con un cepario de microorganismos con potencial como antagonistas del citado patógeno permitirá disponer de opciones para desarrollar productos biopesticidas, capaces de reducir el uso de agroquímicos perjudiciales para el medioambiente, sobre todo, de antibióticos. Cuando se emplean de manera indiscriminada estos últimos generan resistencia y se transforman en un problema de salud pública. Por otro lado, el uso de biopesticidas contribuiría a reducir los costos de producción, con lo que se elevaría el nivel de competitividad del agricultor.

El objetivo del presente trabajo fue aislar, caracterizar, seleccionar e identificar bacterias endofíticas (BE) de cultivos locales de arroz con actividad antimicrobiana frente a B. glumae. Asimismo, se quiso aislar cepas de B. glumae y B. gladioli en áreas de cultivo de arroz de la zona norte del Perú y estudiar su diversidad genética y los factores de virulencia presentes. La hipótesis planteada es que los microorganismos endofíticos aislados de cultivos locales de arroz han coevolucionado con las cepas fitopatógenas de B. glumae que predominan en dicha región y, por ende, podrían presentar actividad antimicrobiana frente a estas.

Material y métodos

Colecta del material vegetal

La colecta de las plantas de arroz sin síntomas de enfermedad se realizó siguiendo la metodología descrita por Baldani et al.⁵ y las de plantas con sintomatología de ABPA de acuerdo con Nandakumar et al.⁴³. Se realizaron muestreos en campos de los departamentos de Tumbes, Piura, Amazonas y San Martín entre junio y agosto de 2018 (tabla 1 del material suplementario). Los campos fueron georreferenciados y se colectaron 3 plantas sanas por parcela. Cada planta fue seccionada en raíz, tallo, hojas, espigas y grano; este material fue transportado a 4 °C hasta el laboratorio. Para obtener aislamientos de agentes causales de ABPA los granos con signos de dicha enfermedad fueron colocados en sobres de papel y transportados al laboratorio a temperatura ambiente.

Aislamiento y conservación de bacterias

Se empleó la metodología descrita por Sun et al.⁵¹ para obtener BE de raíz, hojas y tallos. La confirmación del proceso de desinfección superficial se realizó sembrando una alícuota del último enjuague en TSA (Himedia, India), con incubación a 30 °C por 3 días. Solo las muestras que evidenciaron ausencia de crecimiento bacteriano en dicho medio fueron seleccionadas para el proceso de aislamiento a partir de tejido macerado empleando mortero y pilón estériles. Para aislar bacterias esporuladas y Burkholderia se siguió la metodología sugerida por Cottyn et al.¹³. Para el aislamiento de B. glumae y B. gladioli una alícuota de tejido macerado fue sembrada en el medio selectivo CCNT modificado³³. La composición de dicho medio fue la siguiente: extracto de levadura 2 g/l, peptona 1 g/l, meso-inositol 4 g/l, cetrimide 10 mg/l, cloranfenicol 10 mg/l, novobiocina 10 mg/l, agar-agar 18 g/l en agua destilada. El pH del medio se ajustó a 4,8 y las placas fueron incubadas a 41 °C durante 4 días. La presencia de un pigmento amarillo fluorescente indicaba la producción de toxoflavina por B. glumae y/o B. gladioli. Todos los aislamientos fueron conservados a corto y mediano plazo en cuña de agar y en crioviales con glicerol al 30%, respectivamente, con almacenamiento a −30 °C en el último caso.

Actividad inhibitoria frente a B. glumae

La metodología de selección se realizó de acuerdo a lo descripto por Lima et al.³⁹, empleando discos de papel de filtro estériles (6 mm), y se llevó a cabo en 2 etapas: 1) selección primaria; y 2) selección secundaria. La primera consistió en la evaluación cualitativa (resultado positivo o negativo) de la actividad inhibitoria del conjunto de BE obtenidas frente a B. glumae THT (10 aislamientos BE/placa). B. glumae THT fue sembrada en 2 ml de medio Luria Bertani (LB) e incubada a 180 rpm a 30 °C (24 h), para ser luego sembrada (100 μl) en superficie en placas de Petri con medio King B. Las BE fueron sembradas en 2 ml de TSB e incubadas bajo las mismas condiciones descritas anteriormente. Con alícuotas de 20 μl de cada BE se impregnaron los discos de papel y estos se distribuyeron sobre una placa de Petri previamente sembrada con B. glumae THT. Este material se incubó a 30 °C (72 h). Los aislamientos que generaron un halo de inhibición de al menos 2 mm² pasaron a la etapa de selección secundaria, en la que se midió el área de inhibición de B. glumae THT (en mm²), sembrando una sola cepa de BE/placa. Para la selección secundaria, se empleó la misma metodología de siembra e incubación, tanto para las BE seleccionadas como para B. glumae THT. B. glumae THT fue usada como cepa patrón; esta cepa virulenta fue aislada de granos de arroz de la variedad «La Esperanza», con síntomas del ABPA, obtenidos en la región San Martín.

Amplificación y secuenciación del gen 16S ARNr en BE con capacidad inhibitoria frente a B. glumae THT

Se obtuvieron cultivos líquidos en TSB (24 h, 30 °C, 120 rpm) hasta alcanzar la fase final de crecimiento logarítmico (DO₆₀₀ ≈ 0,6). Posteriormente, las células fueron recogidas mediante centrifugación (13.680 × g, 3 min), a temperatura ambiente. Para la obtención de ADN genómico se utilizó el kit comercial GeneJET Genomic DNA Purification, siguiendo las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). La integridad del ADN extraído fue evaluada luego de ser sometido a electroforesis en gel de agarosa al 1% en tampón Tris borato y tinción con GelRed (Biotium Inc.); la visualización se hizo en un transiluminador UV. Se utilizó como marcador de peso molecular ADN del fago Lambda digerido con la enzima HindIII. La cuantificación del ADN se llevó a cabo utilizando un espectrofotómetro NanoDrop, modelo ND1000 (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). El ADN extraído fue almacenado a −20 °C. La identificación de las bacterias aisladas se realizó mediante el análisis de la secuencia del gen ribosomal 16S. El gen fue amplificado mediante PCR usando los cebadores fD1 y rD1⁵⁴. La especificidad de la amplificación fue verificada visualizando los productos de PCR en un transiluminador UV, luego de separarlos por electroforesis en geles de agarosa al 1% y teñirlos con GelRed (Biotium Inc.). Los productos de PCR fueron secuenciados con la tecnología Sanger como servicio externo en la compañía Macrogen (Seúl, Corea del Sur). Las secuencias obtenidas fueron analizadas en el servidor EzBioCloud para determinar su afiliación taxonómica.

Producción de sideróforos

Las cepas de BE seleccionadas fueron sembradas en caldo LB e incubadas a 37 °C, 200 rpm, durante 24 h. Las células fueron cosechadas en fase estacionaria y, empleando medio succinato normal (SM) y medio succinato desferrado (SM-Fe), fueron lavadas y resuspendidas. La concentración de células fue estandarizada (DO₆₀₀ = 1,0) y con alícuotas de 100 μl de estas suspensiones se inocularon Erlenmeyers (125 ml) que contenían 9 ml de medio SM o medio SM-Fe (0,1% v/v). Tras 30 horas de incubación a 30 °C y 170 rpm se obtuvo el sobrenadante por centrifugación (9.500 × g, 15 min), que se empleó para la cuantificación de sideróforos. La estimación cuantitativa de la producción de sideróforos se realizó a través de la metodología CAS-ShuttleAssay⁴⁸. Se midió a 630 nm la absorbancia de una mezcla de 0,5 ml de sobrenadante y 0,5 ml de reactivo CAS, tomando como absorbancia de referencia aquella correspondiente a 0,5 ml de caldo (SM o SM-Fe) no inoculado + 0,5 ml de reactivo CAS. El porcentaje de unidades de sideróforos fue calculado como ([Ar–As] /Ar)*100, donde Ar fue la absorbancia de la referencia y As la de la muestra⁴⁸.

Resistencia a la toxoflavina

La resistencia a la toxoflavina se evaluó de acuerdo con lo descrito por Choi et al.¹¹. Las BE fueron sembradas en 2 ml de caldo LB e incubadas en agitación a 200 rpm y 37 °C (24 h). Se preparó una solución de toxoflavina (SIGMA-Aldrich) en metanol (25 mg/ml), la cual se almacenó en oscuridad a 4 °C. Se prepararon tubos con 2 ml de caldo LB suplementados con 20 μg de toxoflavina/ml, que fueron inoculados a razón de 1% (v/v), además de un tubo control. Todos ellos se incubaron a 37 °C y 180 rpm durante 24 horas. Un incremento en la DO_{600 nm} = 0,2 en presencia de toxoflavina fue considerado resultado positivo. De la misma manera, se evaluaron 2 concentraciones de toxoflavina mayores: 30 y 40 μg/ml.

Estimación de la diversidad genética de cepas de B. glumae

Las condiciones de crecimiento y extracción de ADN genómico fueron similares a las empleadas con las BE. Para estimar la biodiversidad se generaron perfiles genómicos empleando el cebador BOXA1R, según describen Versalovic et al.⁵². Los productos de PCR se separaron en geles de agarosa al 1,2% preparados en tampón Tris borato. La electroforesis fue realizada empleando una corriente continua de 60 V y los geles fueron fotografiados bajo luz UV. Como marcador de tamaño molecular se utilizó una escalera de fragmentos de ADN de 100 pb a 10 kb. El análisis comparativo de los perfiles electroforéticos obtenidos mediante BOX-PCR fue realizado empleando el paquete informático InfoQuest FP (versión 4.5) (Bio Rad), que contiene el algoritmo UPGMA basado en el coeficiente de correlación de Pearson. Todos los aislamientos con un nivel de similitud igual o superior al 90% en sus perfiles genómicos fueron considerados clones de una misma cepa, y se eligió un solo representante para la identificación taxonómica. Se calculó el índice de diversidad a nivel de cepa como el cociente entre el número de cepas y el número total de aislamientos⁴².

Amplificación y secuenciación parcial del gen 16S ARNr de cepas representantes de B. glumae

La caracterización taxonómica se realizó mediante el análisis de la secuencia del gen ribosomal 16S, tal como ya se describió para las BE con capacidad inhibitoria frente a B. glumae THT.

Evaluación de la virulencia de cepas de B. glumae y B. gladioli

Se siguió la metodología sugerida por Karki et al.³², empleando B. glumae cepas THT, A y B3HT como controles positivos y Rhizobium tropici CIAT 899 como control negativo. Dichas cepas fueron reactivadas y purificadas en TSA e incubadas a 30 °C (48 h). Las cepas de B. glumae, de B. gladioli y las empleadas como controles fueron sembradas en 2 ml de caldo TSB, e incubadas a 30 °C y 180 rpm (48 h). Las células fueron lavadas y resuspendidas en una solución de MgCl₂ 10 mM estéril mediante 2 centrifugaciones sucesivas (9.500 × g, 5 min) y colocadas en microtubos estériles. Se ajustó la DO de cada tratamiento a 0,1 (5 × 10⁵ ufc/ml). Para la prueba de maceración de catáfila de cebolla se colocaron 4 catáfilas de la variedad «Criolla» en placas de Petri limpias y la cara interna de estas se inoculó con 5 μl de la suspensión bacteriana, con la punta de una micropipeta. Estas placas se incubaron a 30 °C durante 48 horas, tras lo cual se midió el área de maceración (en mm²) como indicador del potencial fitopatogénico y, por ende, de la virulencia de las cepas. Se realizaron 4 repeticiones por tratamiento, con un diseño experimental completamente aleatorio (DCA).

Producción de toxoflavina

Se realizó una valoración cualitativa de la producción de toxoflavina por cepas de B. glumae y B. gladioli observando el desarrollo de color amarillo por estrías sucesivas en agar King B, con incubación a 37 °C durante 48 horas. Para la valoración se empleó la siguiente escala: −: sin producción de toxoflavina; +: producción baja; ++: producción intermedia; y +++: producción elevada³².

Producción de pigmentos

Se empleó la metodología sugerida por Karki et al.³². Las cepas purificadas fueron sembradas por estría en el medio CPG (casaminoácidos, 1,0 g/l; peptona 10,0 g/l; glucosa 10,0 g/l, agar-agar 18,0 g/l) e incubadas a 30 °C durante 14 días.

Producción de enzimas extracelulares

Para estimar la producción de proteasas se empleó la metodología sugerida por Huber et al.³⁰ para la de celulasas y poligalacturonasas (pectinasas), la sugerida por Degrassi et al.¹⁴. Para evaluar la actividad proteasa se empleó agar nutritivo suplementado al momento del servido con 1% de leche descremada, bajo condiciones estériles. Para evaluar la actividad celulasa y poligalacturonasa se empleó agar carboxilmetilcelulosa (CMC) y agar pectina, respectivamente. Las cepas fueron sembradas en LB e incubadas a 170 rpm a 30 °C hasta alcanzar la fase estacionaria (24 h). El pellet fue recuperado por centrifugación (9.500 × g, 5 min) y resuspendido en LB, ajustando la concentración celular a una DO₆₀₀ = 1,0. Se inocularon las placas de cada medio con 5 μl de suspensión bacteriana, y se incubó a 37 °C por 48 horas. Estas actividades se determinaron midiendo el halo de hidrólisis formado alrededor de las colonias, expresado como área de hidrólisis (mm²).

Sensibilidad a agentes bactericidas

Se empleó la metodología sugerida por Kim et al.³⁴ para evaluar la sensibilidad al peróxido de hidrógeno (H₂O₂), y la de Maeda et al.⁴⁰ para determinar la sensibilidad al ácido oxolínico (OA). Las cepas fueron sembradas en caldo LB e incubadas en agitación (200 rpm) a 37 °C durante 24 horas, y luego sembradas en superficie (100 μl) en placas de agar TSA. Se embebieron discos de papel de filtro estériles (6 mm) en solución de H₂O₂ (30%) (Himedia®, India) y se dispusieron sobre las placas de Petri, que se incubaron a 37 °C por 24 horas. Se midió el área de inhibición expresado en mm². Para el ensayo de sensibilidad al OA se emplearon discos embebidos con 0, 10, 50, 100, 250 y 500 μg/ml de OA, que se obtuvieron partiendo de una solución de OA (20% p/v) (Oxilobac®, Colombia). Los discos fueron colocados sobre placas de Petri que contenían agar Müller-Hinton (Merck®, Alemania) previamente sembrado en superficie con las cepas de B. glumae y B. gladioli en estudio.

Ensayos de motilidad

Se empleó la metodología sugerida por Kim et al.³⁴. Las cepas de B. glumae fueron estriadas en agar King B para verificar la pureza del cultivo. Cada cepa fue cosechada y resuspendida en caldo LB a una DO₆₀₀ = 1,0. El medio LB fue suplementado al 0,3% de agar para evaluar la capacidad de swarming, y al 0,7% agar para evaluar la capacidad swimming en cada una de las cepas en estudio. Ambas pruebas fueron valoradas empleando la siguiente escala: −: sin motilidad; +, ++ o +++, según el grado de capacidad swimming y swarming.

Análisis estadístico

Los resultados de las pruebas de actividad inhibitoria, producción de sideróforos y virulencia fueron evaluados mediante el test de normalidad Anderson-Darling y verificación de la homocedasticidad. Cumpliendo ambos requisitos se procedió a realizar el ANOVA paramétrico, usando el test de Tukey al 95% como test de comparaciones múltiples, con el objetivo de ver diferencias significativas entre tratamientos, empleando el paquete estadístico InfoStat 2018¹⁵.

Resultados y discusión

Colecta, recuperación y aislamiento de BE

Las BE brindan una serie de ventajas a la planta; se citan entre las principales el biocontrol de fitopatógenos y la producción de factores de promoción del crecimiento^2,29. El arroz constituye el modelo de interacción planta-bacteria endófita más estudiado, y se han reportado endófitos en la raíz¹², las hojas, los tallos y las semillas⁹. En el presente estudio se obtuvieron 189 aislamientos de BE (tabla 1), con mayor recuperación de endófitos de raíz y tallo, tal como reportaron Mbai et al.⁴¹. Las BE provienen del suelo⁷, pasando transitoriamente como endofíticas¹⁷ y, finalmente, solo algunas seleccionadas son transmitidas por el grano²⁵.

Tabla 1.

Distribución de los aislamientos de BE de arroz de acuerdo con el origen y órgano seleccionado

Departamento	Raíz	Hoja	Tallo	Panícula	Grano	Total
Piura	14	0	10	4	0	28
Tumbes	19	6	9	8	4	46
Amazonas	11	11	17	0	8	47
San Martín	20	19	14	0	15	68
Subtotal	64	36	50	12	27	189
%	33,9	19,0	26,5	6,5	14,3

Selección de BE con capacidad inhibitoria contra B. glumae

En la selección primaria de las 189 BE obtenidas solo 34 (18,0%) fueron capaces de inhibir el crecimiento de B. glumae THT. La inhibición de crecimiento fue variable, con áreas de inhibición desde 2 hasta 451 mm² (datos no mostrados).

El control de B. glumae ofrece alternativas químicas, culturales y biológicas²⁶; este último es un componente importante en el manejo integrado de la enfermedad⁴⁹. Actualmente destacan el uso de agentes de biocontrol como Paenibacillus polymyxa JH2³⁵, Bacillus amyloliquefaciens⁴⁹, Bacillus oryzicola¹², B. gladioli⁴⁷ y Streptomyces⁵⁰, así como la búsqueda metagenómica de enzimas degradadoras de toxoflavina¹¹.

En la selección secundaria solo 9 aislamientos (26,5% de los 34 reunidos en la selección primaria y 4,8% sobre los aislamientos totales) fueron confirmados con actividad inhibitoria mayor de 150 mm² (tabla 2, figs. 1 A y B). De esos 9 aislamientos 5 fueron endófitos radiculares, 2 caulinares y 2 foliares. No se encontraron BE con capacidad inhibitoria del crecimiento de B. glumae THT procedentes de espiga ni de grano.

Tabla 2.

Caracterización de bacterias endófitas de arroz procedentes de la zona norte del Perú preseleccionadas por su capacidad inhibitoria frente a Burkholderia glumae cepa THT

Cepa	Área de inhibición del crecimiento de B. glumae THT (mm^2)	Producción de sideróforos (%)		Resistencia a la toxoflavina (μg/ml)^a			Especie tipo más relacionada. Cepa tipo ^(T)	Similitud (%)	16S ARNr (pb)^b	Número de acceso
		+ Fe^c	- Fe^d	20	30	40
TUR07-04	283 (±38) D	ND	ND	+++	+	-	Bacillus megaterium NBRC 15308 ^(T)	99,93	1379	MK449441
TUR04-03	517 (±16) B	86,56 (± 2,59) A	97,36 (± 0,24) A	+++	+	+	Burkholderia vietnamiensis LMG 10929 ^(T)	99,93	1403	MK449433
TUT05-02	301 (±7) CD	ND	ND	+	+	+	Bacillus megaterium NBRC 15308 ^(T)	100,00	1403	MK449447
TUR07-02	254 (±8) D	ND	ND	+	+	+	Bacillus velezensis CR-502 ^(T)	99,78	1402	MK449448
TUR04-01	618 (±25) A	25,47 (± 0,69) B	95,39 (± 0,52) A	+++	+	+	Burkholderia vietnamiensis LMG 10929 ^(T)	99,72	1421	MK449435
AMH12-02	330 (±13) C	ND	17,18 (± 2,65) CD	++	+	+	Bacillus aryabhattai B8W22 ^(T)	99,93	1379	MK449446
SMBR13-04	158 (±9) E	11,10 (± 0,55) C	16,00 (± 1,47) D	-	-	-	Bacillus aryabhattai B8W22 ^(T)	100,00	1466	MK449444
SMBH14-02	180 (±5) E	18,90 (± 2,80) BC	55,84 (± 3,20) B	+	+	-	Bacillus megaterium NBRC 15308 ^(T)	99,79	1438	MK449443
SMNCT17-02	245 (±9) DE	ND	24,94 (± 0,24) C	++	-	-	Bacillus subtilis subsp. stecoris D7XPN1 ^(T)	99,76	1437	MK449440
CV (%)	8,64	11,75	8,23

Valores seguidos por letras distintas indican diferencias significativas (test de Tukey; p = 0,05; n = 6).

ND: no detectado.

a

Ensayo en caldo nutritivo suplementado con 20 μg ml^̄1 de toxoflavina.

b

Longitud en pares de bases de la secuencia del gen 16S ARNr amplificado.

c

Medio SM normal con trazas de Fe.

d

Medio SM desferrado.

Figura 1.

Actividad inhibitoria de B. vietnamiensis TUR04-03 (A) y B. aryabhattai AMH12-02 (B) contra B. glumae THT en medio TSA incubado a 30 °C por 72 horas.

Caracterización genética de las BE seleccionadas

Las BE con actividad inhibitoria del crecimiento de B. glumae THT correspondieron a los géneros Burkholderia y Bacillus, de acuerdo con el análisis filogenético de la secuencia del gen 16S ARNr (tabla 2).

Las cepas TUR04-01 y TUR04-03 presentaron un 99,93% y 99,72% de identidad, respectivamente, con Burkholderia vietnamiensis LMG 10929^T. Por su versatilidad ecológica y habilidad para usar una gran variedad de compuestos como única fuente de carbono y producir metabolitos secundarios, no sorprende que el género Burkholderia constituya una alternativa de biocontrol para otros miembros del mismo género^10,47.

Las cepas SMBH14-02, TUT05-02 y TUR07-04 presentaron un 99,79%, 100% y 99,93% de identidad, respectivamente, con Bacillus megaterium NBRC 15308^T. Las cepas AMH12-02 y SMBR13-04 presentaron un 99,93% y 100% de identidad, respectivamente, con Bacillus aryabhattai B8W22^T. La cepa SMNC17-02 presentó una identidad del 99,76% con Bacillus subtilis subsp. stecoris D7XPN1^T y, finalmente, la cepa TUR07-02 fue un 99,78% idéntica a la cepa Bacillus velezensis CR-502^T (tabla 2). El género Bacillus tiene un uso potencial en el biocontrol de bacterias fitopatógenas^8,16,45, debido a la producción de una serie de lipopéptidos antimicrobianos como la iturina y la surfactina, así como la jinggangmicina⁴⁶.

Producción de sideróforos por BE seleccionadas

La oxidación del hierro (Fe²⁺ a Fe³⁺) se da en presencia de oxígeno y a pH neutro, y la forma oxidada es poco soluble y no disponible para las bacterias; es por ello que la producción de sideróforos constituye una estrategia directa para la nutrición bacteriana en condiciones limitantes de hierro⁵³. El 44,4% de las BE antagonistas produjeron sideróforos en medio de cultivo con trazas de Fe³⁺, mientras que el 66,7% produjeron sideróforos en medio desferrado. Todas las cepas incrementaron la producción de sideróforos cuando en el medio líquido hubo privación del hierro (tabla 2).

Las cepas de B. vietnamiensis TUR04-01 y TUR04-03 produjeron la mayor concentración de sideróforos solubles, tanto en presencia de hierro como en medio desferrado (tabla 2). Se ha reportado que el salicilato, la ornibactina y la maleobactina constituyen los sideróforos más comunes producidos por el género Burkholderia^19,23. El género Bacillus, a diferencia del género Burkholderia, produce sideróforos del tipo catecoles (bacilibactinas), que favorecen el crecimiento de la planta y protegen contra patógenos⁴.

La producción de sideróforos se ha asociado al control de fitopatógenos por limitación del Fe en el medio de cultivo. En nuestro estudio la actividad inhibitoria de las BE contra B. glumae THT estuvo correlacionada de manera positiva con la producción de sideróforos en condiciones normales de Fe (r = 0,58) así como en ausencia de Fe (r = 0,74).

Resistencia a la toxoflavina por BE seleccionadas

La toxoflavina es una fitotoxina con características antimicrobianas, antifúngicas e incluso herbicidas, que genera peróxido de hidrógeno (H₂O₂) en presencia de luz y oxígeno, interrumpiendo la cadena respiratoria del arroz⁴⁴. Se han reportado cepas bacterianas capaces de tolerar hasta 40 μg/ml de toxoflavina, y es suficiente > 3 μg/ml para inhibir el crecimiento de Escherichia coli³⁵.

Se ha informado de que la cepa JH2 de P. polymyxa, aislada de semillas de arroz sanas, presenta el gen tflA, que expresa una enzima degradadora de esta fitotoxina³⁵. Un estudio de metagenómica de Choi et al.¹¹ da cuenta del gen txeA, que codifica una metaloenzima con actividad degradadora de toxoflavina. A la concentración de 20 μg/ml, 8 cepas portadoras de dicho gen fueron capaces de tolerar (DO₆₀₀ < 0,5) toxoflavina, mientras que B. aryabhattai SMBR13-04 fue sensible. Asimismo, B. subtilis subsp. stecoris SMNCT17-02 fue sensible a 30 μg/ml. Solo el 55,6% fue tolerante a 40 μg/ml de toxoflavina (tabla 2). Sería interesante determinar la posible presencia de los genes tflA o txeA en el genoma bacteriano de las cepas endofíticas tolerantes a toxoflavina.

Aislamiento, diversidad genética e identificación de cepas nativas de B. glumae y B. gladioli

Se obtuvieron 17 aislamientos en medio CCNT modificado, 16 de grano y uno de tallo. Las 17 cepas fueron agrupadas en 10 perfiles genómicos BOX diferentes (A, B, C, D1, D2, D3, E1, E2, E3, E4) (tabla 3). Se eligió una cepa representante de cada perfil genómico para posteriores estudios de confirmación filogenética y caracterización de los principales factores de virulencia. La técnica de huella genómica BOX-PCR es ampliamente usada debido a su destacado poder de resolución intercepa, atendiendo a sus diferencias genómicas^13,31.

Tabla 3.

Caracterización de aislamientos de B. glumae y B. gladioli obtenidos de muestras de grano y tallo de arroz cultivado en cuatro departamentos de la zona norte del Perú

Perfil BOX	Cepa(s)^a	TOX	PP	Virulencia	Proteasas	Celulasas	Poligalacturonasa	Especie(s) más relacionada(s) según 16S ARNr
				Área de maceración catáfila (mm^2)	Área de proteólisis (mm^2)	Área de hidrólisis (mm^2)
A	TUG05-07; TUG05-08	+	AC	51,07 (± 0,15) H	31,18 (±0,74) AB	0	-	Burkholderia gladioli NBRC13700^T
B	TUT05-07	+++	SP	87,08 (± 5,05) GH	26,10 (±0,20) BC	0	+	Burkholderia glumae LMG2196^T
C	TUG07-05; TUG07-07	++	A	72,73 (± 3,65) GH	31,65 (±0,53) A	3,44 (±0,43) BC	-
D1	TUG07-08	++	A	180,37 (±8,87) CDE	27,90 (±0,37) ABC	2,41 (±0,38) CD	+
D2	TUG07-09	+	A	157,41 (±2,27) DEF	27,88 (±0,47) ABC	2,35 (±0,27) CD	-
D3	TUG07-11; AMG08-02	+	MA	127,5 (±12,00) EFG	24,94 (±0,88) C	1,57 (±0,11) D	+
E1	AMG09-01; AMG09-02; AMG09-09	++	SP	230,4 (±12,56) BC	32,02 (±1,67) A	0	-
E2	AMG12-06	+	A	38,2 (±7,43) H	13,68 (±0,92) E	0	+
E3	SMNCG18-05; SMNCG18-07	+	MA	375,58 (±1,80) A	28,86 (±1,22) ABC	6,55 (±0,33) A	+
E4	SMNCG18-06; SMNCG18-08	+	MA	244,69 (±5,20) B	19,48 (±0,97) G	4,35 (±0,34) B	-
E5	B3HT	+	SP	148,86 (±7,49) DEF	8,18 (±0,75) F	0	-
ND	A	+	SP	109,85 (±2,99) FG	31,93 (±1,47) A	0	-
ND	THT	++	A	187,96 (±4,02) BCD	29,17 (±1,22) ABC	0	-
	CV (%)			20,06	6,8	23,52

Valores seguidos por letras distintas indican diferencias significativas (test de Tukey; p = 0,05).

a

Código de cepa representante de perfil BOX-PCR en negrita; TOX (producción de toxoflavina): ausente (–), mínimo (+), intermedia (++) y abundante (+++); PP (producción de pigmentos): azul (A), marrón en los bordes y azul en el centro (MA), sin producción de pigmentos (SP), bordes color crema y amarillo (AC); Burkholderia glumae B3HT (MK027360); Burkholderia glumae A (MK027361); Burkholderia glumae THT (MK027359).

En nuestro estudio se observó una diferenciación genómica entre cepas de B. glumae acorde con su distribución geográfica. Lee et al.³⁶ demostraron que cepas de B. glumae de diferentes orígenes geográficos presentan rearreglos genómicos irregulares y esporádicos, sobre todo reordenamientos de elementos genéticos por inversión a gran escala, lo cual permite su adaptación a nuevos ambientes.

La amplificación y secuenciación parcial del gen 16S ARNr de las 10 cepas representantes de cada perfil genómico BOX-PCR detectó similitud entre 9 de ellas (perfiles B, C, D1, D2, D3, E1, E2, E3 y E4) y B. glumae LMG2196^T; la cepa restante (perfil A) la presentó con B. gladioli NBRC13700^T. En nuestro estudio solo un aislamiento fue recuperado de tallo e identificado como B. glumae, probablemente debido al estilo de vida endofítico³⁸.

Caracterización de los factores de virulencia de las cepas de B. glumae y B. gladioli

La producción de toxoflavina fue superior en la cepa B. glumae TUT05-07 (tabla 3). La toxoflavina es producida tanto por B. glumae como por B. gladioli bajo el control del regulador transcripcional ToxR del operón toxABCDE²², y constituye el principal factor de virulencia, aunque se ha reportado que la virulencia es menor en B. gladioli^31,36.

Los pigmentos desempeñan un rol importante en la adaptación ecológica de los microorganismos, asociados a la protección frente a las radiaciones o a la exacerbación de los factores de virulencia³². Dos cepas nativas y 2 cepas patrón de B. glumae no produjeron pigmentos visibles ni en colonias ni difusibles al medio. Se detectó producción de un pigmento azul en 4 cepas nativas y en la cepa patrón B. glumae THT. Tres cepas nativas y una cepa patrón produjeron pigmento azul, pero los bordes fueron marrones (tabla 3). Karki et al.³¹ reportaron que cepas de B. glumae produjeron pigmentos con propiedades antimicrobianas y que, además, incrementaron la tolerancia a luz UV, y se postula que dichos pigmentos pueden ser utilizados para sobrevivir en condiciones oligotróficas o de estrés^27,32.

El ensayo de virulencia en catáfila de cebolla mostró que la cepa B. glumae SMNCG18-05 produjo la mayor área de maceración, mientras que la menor la produjo B. glumae AMG12-06 (tabla 3). Karki et al.³¹ informaron de que existe una correlación directa entre el ensayo de maceración de catáfila de cebolla y la prueba de infectividad en panículas de arroz³¹, por lo que la primera constituye una prueba rápida y de menor costo para determinar la virulencia de cepas de B. glumae. Nosotros no observamos correlación entre los niveles de maceración de catáfila de cebolla y la producción de toxoflavina (r = −0,05). Aunque la producción de toxoflavina en B. glumae está a menudo asociada a un fenotipo virulento, no es condición suficiente para provocar enfermedad, según postulan Karki et al.³².

En relación con las enzimas extracelulares que pueden ayudar en los procesos de colonización e infección se encuentran proteasas, celulasas y poligalacturonasas (pectinasas). El 80% de las cepas presentaron actividad proteasa un día después de la siembra; sin embargo, todas las cepas mostraron actividad proteasa, en mayor o menor grado, después de 3 días de incubación (tabla 3). La producción de proteasas extracelulares en el género Burkholderia es muy común⁵⁶. Esta actividad puede cobrar importancia en etapas avanzadas de la enfermedad, cuando se requieren polipéptidos, oligopéptidos y aminoácidos, que pueden ser liberados a partir de la hidrólisis de las proteínas del tejido vegetal³. Lelis et al.³⁷ comunicaron que la metaloproteasa codificada por el gen prtA constituye un factor de virulencia de B. glumae.

El 53,3% de las cepas demostró actividad celulolítica; la máxima actividad se detectó en la cepa B. glumae SMNCG18-05 (tabla 3). En otros patógenos las celulasas hidrolizan la pared celular de la planta huésped y desempeñan un papel importante y sinérgico en la patogénesis, junto con otras enzimas hidrolíticas. Hasta el momento no se ha reportado actividad celulolítica en B. glumae y B. gladioli; sin embargo, se infiere de estos hallazgos que las celulasas producidas podrían tener un rol sinérgico en la virulencia⁵³. Prueba de ello es la correlación obtenida entre la maceración de catáfila y la producción de celulasas (r = 0,61).

Finalmente, se hallaron 5 cepas de B. glumae con actividad poligalacturonasa evaluada cualitativamente (tabla 3). Se ha propuesto que la actividad poligalacturonasa en bacterias fitopatógenas ayudaría a obtener nutrientes de la pared celular cuando la enfermedad se encuentra en un estado avanzado¹⁴. B. glumae expresa 2 isoformas de endopoligalacturonasas (pehA y pehB)⁴⁹ y la actividad enzimática depende principalmente de la densidad celular, la fuente de carbono y los productos de descomposición de los polímeros de pectina²⁶. No se ha informado actividad poligalacturonasa en B. gladioli¹⁸. Por otro lado, el 58,3% no presentó actividad, probablemente debido a la carencia de los citados genes, o a una actividad débil debido a la expresión del gen pehB solamente bajo condiciones in vitro. No se encontró una correlación entre la virulencia y la actividad poligalacturonasa. Degrassi et al.¹⁴ reportaron que cepas mutantes de B. glumae (pehA⁻ y pehB⁻) presentaron similar virulencia que las cepas originales en panículas de arroz.

La cepa B. glumae SMNCG18-05 presentó la mayor sensibilidad al H₂O₂, mientras que la cepa B. glumae TUT05-07 fue la más resistente (tabla 4). La tolerancia al H₂O₂ se asocia con la presencia y efectividad de las enzimas catalasa y peroxidasa para superar el estrés oxidativo por H₂O₂. La catalasa permite la detoxificación del H₂O₂ evitando el daño oxidativo en las células microbianas. Curiosamente, la correlación entre actividad celulolítica y sensibilidad al peróxido de hidrógeno fue elevada (r = 0,80), es decir, una mayor actividad endoglucanasa (endo-1,4-β-glucanasas), celobiohidrolasa (exo-1,4-β-glucanasas) y β-glucosidasa⁴⁶, por alguna circunstancia, está relacionada con una menor actividad catalasa y/o peroxidasa en las cepas de B. glumae.

Tabla 4.

Factores de virulencia en cepas de B. glumae y B. gladioli obtenidas de grano y tallo de arroz cultivado en 4 departamentos de la zona Norte del Perú

Cepa	Sensibilidad al H2O2	Sensibilidad al ácido oxolínico (μg/ml)Área de inhibición (mm^2)			Ensayos de motilidad
	Área de inhibición (mm^2)	10	50	100	Swimming	Swarming
B. glumae TUG07-08	120,40 (±9,00) B	64,45 (±1,54) BC	210,26 (±31,27) ABC	248,53 (±31,27) A	-	++
B. glumae TUG07-09	102,10 (±1,10) BC	0	154,53 (±6,77) BC	179,45 (±8,50) ABCD	-	++
B. glumae TUG07-11	68,90 (±4,80) CDE	0	172,30 (±8,80) ABC	185,74 (±8,80) ABC	+++	+
B. glumae SMNCG18-06	108,50 (±6,70) B	37,90 (±1,10) CD	166,54 (±22,38) BC	202,14 (±22,38) ABC	+++	++
B. glumae B3HT	60,20 (±2,90) DEF	0	124,89 (±5,98) BCD	134,93 (±5,98) BCD	-	-
B. glumae THT	33,70 (±2,20) EF	38,62 (±4,46) CD	183,49 (±13,51) ABC	207,96 (±13,51) ABC	+++	++
B. gladioli TUG05-07	40,90 (±5,60) EF	0	0	0	-	++
B. glumae TUT05-07	29,2 (±3,10) F	0	57,56 (±5,20) DE	113,70 (±8,18) CDE	++	++
B. glumae TUG07-05	95,6 (±9,40) BCD	0	1,64 (±0,52) E	66,89 (±2,07) DE	+	+
B. glumae AMG09-01	100,00 (±5,10) BC	0	179,46 (±8,13) AB	210,26 (±31,28) ABCD	-	+
B. glumae AMG12-06	62,60 (±11,00) DEF	105,43 (±22,07) A	238,72 (±32,39) A	253,30 (±21,98) AB	+	++
B. glumae SMNCG18-05	164,10 (±9,20) A	93,28 (±13,98) AB	207,34 (±9,86) AB	222,79 (±13,17) AB	+	+
B. glumae A	37,50 (±5,90) EF	70,98 (±3,86) ABC	173,33 (±10,32) ABC	232,21 (±12,08) AB	+	++
CV (%)	15,04	36,45	19,77	22,60

Valores seguidos por letras distintas indican diferencias significativas (test de Tukey; p = 0,05; n = 6).

La hipótesis de una actividad celulolítica superior dependiente de una menor resistencia al H₂O₂ podría explicar esta elevada correlación. Forsberg et al.²¹ informaron de la presencia de monooxigenasas líticas de polisacáridos dependientes de cobre en actinobacterias, que requieren H₂O₂ para clivar polisacáridos como la celulosa. Si bien no ha sido reportada en patógenos de plantas, se recomienda la búsqueda de esta actividad enzimática específica para comprobar dicha hipótesis.

Al menos 7 cepas (46,7%) presentaron resistencia a 10 μg/ml de OA; la sensibilidad a este antibiótico fue variable y mayor en B. glumae AMG12-06. Al aumentar la concentración, la mayoría de las cepas se mostraron más o menos sensibles. Solo B. gladioli TUG05-07 puede ser considerada como altamente resistente (tabla 4).

La resistencia intrínseca a los antibióticos es un indicativo de adaptación ecológica al ambiente, y en la mayoría de los casos refleja uso inadecuado de antibióticos³⁰. Se ha reportado una fácil generación de resistencia en aislamientos de B. glumae, asociada a las sustituciones Ser83Arg y Ser83Ile en GyrA⁴⁰. En Perú han existido reportes de uso indebido de OA mediante aplicaciones clandestinas desde 2013, las cuales podrían influir en la generación de cepas resistentes.

La motilidad tipo swimming y swarming desempeña un papel fundamental en el comportamiento social y virulento de B. glumae²⁶. El movimiento a través de un líquido empleando flagelos se denomina swimming, y cuando el movimiento ocurre sobre una superficie, como una biopelícula, se denomina swarming³⁴. Las cepas con mayor capacidad de swimming correspondieron a B. glumae TUG07-11, SMNCG18-06 y THT; por el contrario, la actividad estuvo ausente en B. gladioli TUG05-07, probablemente porque carece de flagelos y, por ende, tiene menor capacidad invasiva (figs. 2 A y B).

Figura 2.

Diferentes niveles de swimming en B. glumae TUG07-09 (A) y B. glumae TUG07-11 (B) creciendo en LB suplementado con 0,5% agar.

Se observó una correlación débil positiva (r = 0,20) y negativa (r = −0,22) entre la virulencia, el swimming y el swarming, respectivamente. La motilidad es uno de los factores de virulencia cruciales para B. glumae³⁴.

En conclusión, encontramos que cepas nativas de 3 especies de Bacillus, además de B. vietnamiensis, son endófitos con actividad inhibitoria contra B. glumae THT bajo condiciones in vitro, con características relacionadas con el biocontrol. Asimismo, este constituye el primer reporte sobre la diversidad genética y el estudio de los principales factores de virulencia de cepas de B. glumae y B. gladioli aisladas en Perú. La gran variabilidad genética encontrada entre las cepas de B. glumae y B. gladioli y la diversa expresión de factores de virulencia nos demuestra la elevada adaptabilidad de estos patógenos al medio ambiente. Es preciso lograr una mejor comprensión de la enfermedad para poder diseñar estrategias de control de estas enfermedades empleando agentes microbianos.

Financiación

El presente trabajo ha sido financiado por la Universidad Nacional de San Martín-Tarapoto-Perú, con resolución n.° 296-2018-UNSM/CU-R/NLU; Red Agromicrobios-Universidad Nacional Agraria La Molina-Perú.

Conflicto de intereses

Los autores han declarado que no presentan ningún conflicto de intereses existentes.

Agradecimientos

A los bachilleres Luz E. Valdiviezo Saavedra, Jean C. Rodríguez Peralta y Rony Castro Tuanama por el apoyo en los trabajos de caracterización genética.