Las contaminaciones microbianas representan una preocupación significativa para la industria cervecera porque impactan negativamente en la calidad organoléptica del producto y generan pérdidas económicas sustanciales. El desarrollo de las cervecerías artesanales en Argentina ha experimentado un crecimiento exponencial en los últimos años, lo que requirió mejoras continuas en los procesos para garantizar la excelencia en la producción cervecera. No obstante, la rigurosidad en los controles de calidad microbiológicos sigue siendo un área vulnerable. Este estudio evaluó la incidencia de contaminantes cerveceros en muestras de cerveza provenientes de 10 fábricas ubicadas en la Ciudad de Buenos Aires (CABA) y Gran Buenos Aires (GBA). Se detectaron microorganismos en el 70% de las muestras analizadas. Se logró el aislamiento de 15 bacterias y 19 levaduras; las primeras se identificaron como pertenecientes a los géneros Acetobacter y Staphylococcus, las levaduras como miembros de los géneros Saccharomyces, Lodderomyces, Candida y Pichia. La precisa identificación de estos microorganismos proporciona a los productores la información necesaria para desarrollar un plan de acción dirigido a mejorar los protocolos de limpieza y sanitización en sus instalaciones. Este enfoque proactivo no solo tiene el potencial de mitigar las pérdidas económicas asociadas con la contaminación microbiana, sino que también contribuye a mantener o elevar los estándares de calidad en la producción de cervezas artesanales en la región.
Microbial contaminations pose a significant concern within the brewing industry, exerting negative effects on the organoleptic quality of the product and leading to substantial economic losses. The exponential proliferation of craft breweries in Argentina in recent years has heightened the demand for constant improvements in processes to ensure excellence in beer production. However, the stringency of microbiological quality controls remains a vulnerable area. This study assesses the prevalence of beer contaminants in samples from 10 breweries located in Buenos Aires City (CABA) and Greater Buenos Aires area (GBA). The results revealed the presence of microorganisms in 70% of the analyzed samples. Fifteen bacteria and 19 yeasts were successfully isolated, with bacteria belonging to the genera Acetobacter and Staphylococcus, and yeasts to the genera Saccharomyces, Lodderomyces, Candida, and Pichia. Accurately identifying these microorganisms provides producers with the necessary information for formulating action plans to improve cleaning and sanitization protocols in their facilities. This proactive approach not only has the potential to mitigate economic losses associated with microbial contamination but also contributes to maintaining and elevating quality standards in regional craft beer production.
La producción de cerveza artesanal en Argentina es parte de un sector productivo emergente y ha experimentado un continuo crecimiento durante los últimos 20 años24,46. Este aumento sin precedentes obliga al sector a incorporar nuevas tecnologías que permitan generar productos de mayor calidad y estabilidad en el tiempo. Se ha demostrado que la contaminación microbiana es uno de los factores más importantes que afectan la calidad de la cerveza2,28.
La Ciudad Autónoma de Buenos Aires (CABA) y el Gran Buenos Aires (GBA) conforman la región más poblada de Argentina, y, por lo tanto, no son territorios ajenos al auge del sector cervecero. Este crecimiento genera un gran impacto en la economía regional, ya que, además de producir múltiples puestos de trabajo, ayuda a diversificar las matrices productivas e impacta positivamente en otros sectores económicos, como el gastronómico2. Actualmente, la región cuenta con más de 230 cervecerías (que representan el 30% de las del país), más otro centenar de pequeños productores que están a la espera de dar el salto y lograr consolidar sus emprendimientos (Cámara de Cervecerías Artesanales de Argentina [CCAA]). Con la crisis económica existente, es importante minimizar las pérdidas de producción y, por lo tanto, es vital aplicar metodologías de control de calidad. Tan importante es que, en los últimos años, las microcervecerías comenzaron a contratar personal calificado para que realicen dichos controles en laboratorios internos.
La mayoría de las cervezas son fermentadas por un monocultivo, si bien existen algunos estilos donde se pueden usar combinaciones de cepas de levaduras, o, incluso, inoculaciones con bacterias para generar cultivos mixtos7. Debido a que durante la elaboración de la cerveza se realiza un hervor prolongado, cualquier microorganismo que no sea agregado por el cervecero se considera un contaminante19. Asimismo, a diferencia de otras bebidas fermentadas, la cerveza es un ambiente hostil para el desarrollo de microorganismos. El porcentaje de etanol, la escasa cantidad de azúcares después de la fermentación, el bajo pH, el alto contenido de CO2 y la presencia de lúpulo dificultan el crecimiento de muchos microorganismos19,40. Sin embargo, existen algunos capaces de crecer en la cerveza7,38, por lo que su correcta y pronta identificación en el proceso de elaboración es crucial, ya que permite anticiparse tanto a problemas organolépticos en el producto final como a cambios en los parámetros fisicoquímicos y rendimientos del proceso en general28,34.
Por el interés que reviste el tema, en este trabajo se efectuó un primer relevamiento de la incidencia de contaminantes microbianos en la producción de cerveza artesanal en CABA y GBA. El objetivo fue realizar un estudio integral que incluyera el análisis microbiológico y fisicoquímico de las cervezas seleccionadas, aislar posibles contaminantes, identificar por técnicas de biología molecular y bioinformática los contaminantes aislados, evaluar la existencia de correlación entre las propiedades fisicoquímicas de la cerveza y la presencia de contaminantes, y, por último, contribuir con los microorganismos contaminantes identificados a la consolidación de un banco nacional de contaminantes cerveceros en el marco del Centro de Referencia en Levaduras y Tecnología Cervecera (CRELTEC-CONICET).
Materiales y métodosToma de muestrasSe estudiaron un total de 10 fábricas de cerveza en diferentes localidades de CABA y del área metropolitana de la Provincia de Buenos Aires aledaña a CABA (GBA). De cada cervecería, en envases estériles se colocaron muestras de 500ml a partir de 3 barriles de 50 l de capacidad pertenecientes a un mismo lote de producción no pasteurizado. Cada barril se consideró como una muestra independiente debido a posibles episodios de contaminación secundaria, de modo que se reunieron en total 30 muestras. Los muestreos se realizaron entre enero y octubre de 2019, las muestras se conservaron a 4°C hasta su análisis, efectuado dentro de las 24 h posteriores.
La participación de cada fábrica en este estudio fue voluntaria; los productores participantes tuvieron que completar una encuesta con datos relevantes del establecimiento en lo referente a la elaboración del producto (manejos del control de calidad en el proceso productivo, limpieza del establecimiento) y la capacidad productiva, así como del lote específico del producto muestreado (fig. S1). Se analizaron parámetros relacionados con la fabricación de la cerveza en general, como tamaño de lote, producción anual, agentes de limpieza y sanitización utilizados, y se evaluó la detección de contaminantes microbianos, el control de las propiedades fisicoquímicas en la elaboración (temperatura, pH, medición de densidad inicial y final), las condiciones de almacenamiento de barriles y la información de la levadura utilizada (cepa y formato) (tabla S1). Se comparó el grado de amargor (International Bitterness Units [IBU]) declarado por el productor con el IBU medido analíticamente en este estudio aplicando la siguiente fórmula:[ΔIBU=(IBUdec-IBUmed)/IBUmed]
También se compararon las mediciones de densidad final (DF) aportadas por el productor con respecto a las medidas en laboratorio (ver «Análisis fisicoquímico»). Se procuró seleccionar lotes con menos de un mes de elaboración y barriles almacenados en cámaras frías por debajo de los 4°C.
Análisis microbiológicoEl análisis de la prevalencia de microorganismos contaminantes constó de un análisis de observación directa de la muestra con microscopio óptico y un análisis cualitativo y cuantitativo utilizando distintos medios de cultivo selectivos y diferenciales.
Se realizaron preparados frescos de una alícuota de 5μl en condiciones de esterilidad y se observaron en un microscopio óptico OLYMPUS CX-31 utilizando aumentos de 400x y 1000x con aceite de inmersión. Se registraron los tipos de morfología celular tanto de las levaduras como de las bacterias halladas. A partir de esa observación microscópica se juzgó la carga microbiana de cada muestra y, por tanto, la necesidad de diluir con agua desionizada estéril para proceder con el resto de los análisis.
El análisis cualitativo y cuantitativo utilizando distintos medios de cultivo incluyó la pesquisa de bacterias aeróbicas totales, bacterias ácido lácticas (BAL) y levaduras contaminantes. La detección de bacterias totales se realizó en agar mosto con cicloheximida (AMC)21. Para la detección de BAL, se utilizó el medio de cultivo de Hsu semisólido para Levilactobacilli, Lactobacilli y Pediococcus (HLP Medium, Siebel Institute)11. Para esta determinación, en tubos Falcon de 15ml se colocó 14ml del medio de cultivo y 1ml de muestra, la incubación fue a 30°C durante 48-72h. Transcurrido el tiempo de incubación, se determinó la presencia o ausencia de colonias dentro del tubo. Cabe mencionar que la detección de BAL utilizando HLP no permite el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC), por lo que el recuento de bacterias se realizó únicamente sobre el medio de cultivo agar mosto. El medio HLP tiene la particularidad que permite identificar, según el tipo de colonia generado en el tubo, si esta pertenece al género Lactobacilli (forma de gota invertida) o Pediococcus (forma de cometa). Para la detección de levaduras contaminantes, alícuotas de 100μl de muestra se sembraron en superficie en placas con medio sulfato de cobre de Lin (LCSM) e incubaron durante 48 - 72h a 25°C, después se realizó el recuento de UFC/ml. Este es un medio selectivo para detectar levaduras salvajes, está diseñado para favorecer el crecimiento de levaduras no sacaromicéticas cerveceras por la presencia de sulfato cúprico25.
Se consideró que la muestra de cerveza estaba contaminada cuando el recuento de UFC fue mayor o igual a 10UFC/ml en al menos uno de los medios sólidos (AMC y LCSM), o cuando se registró crecimiento de colonias en el medio semisólido HLP. Este límite fue definido según lo sugerido por Hill14 para la detección de bacterias y se extrapola para la detección de levaduras, según Latorre et al. (2022).
Análisis fisicoquímicoSe utilizaron los métodos de análisis propuestos por la American Society of Brewing Chemists (ASBC), en sus Methods of Analysis (MOA), para medir los parámetros fisicoquímicos de cada muestra. Estos fueron pH, azúcares residuales, color, turbidez y amargor. El pH de las muestras se midió según el MOA-Beer 9 (1, después de su descarbonatación). El valor de azúcares residuales (̊Plato) se determinó por medio de un refractómetro (Alla France-ATC), y se utilizó para calcular el porcentaje de atenuación según el MOA-Beer 6. El color y la turbidez se determinaron según el MOA-Beer 10, las muestras se descarbonataron y filtraron (0,45μm) y luego se registró la absorbancia a 430nm para calcular los Standard Reference Method (SRM), y a 700nm para evaluar la presencia o ausencia de turbidez. El amargor se estimó mediante espectrofotometría según el MOA-Beer 231; para ello, los iso-alfa ácidos se extrajeron utilizando iso-octano en medio ácido como solvente y luego se midió la absorbancia a 275nm. Cada ppm de iso-alfa ácido es equivalente a 1 IBU.
Aislamiento y conservación de microorganismos contaminantesLas bacterias y levaduras obtenidas a partir de los cultivos selectivos fueron conservadas a −80°C utilizando glicerol (20% v/v) como crioprotector. Las muestras que contenían más de una morfología de bacterias o levaduras se aislaron como cepas independientes mediante la técnica de estriado en placa. Estos microorganismos contaminantes fueron ingresados al banco de contaminantes del CRELTEC, perteneciente al Instituto Andino Patagónico de Tecnologías Biológicas y Geoambientales (IPATEC), CONICET-UNComahue.
Identificación molecularSe estudiaron los aislamientos mediante técnicas moleculares de secuenciación de genes ribosomales (ARNr). Para extraer el ADN total de bacterias y levaduras se realizó el protocolo de lisis básica sobre colonia aislada. Se realizó un primer paso de lisis en NaOH 20mM (20μl para levaduras y 50μl para bacterias), seguido de una agitación en vórtex. Posteriormente, se realizó una incubación en un baño a 95°C por 10 min. Como paso final, se precipitaron las impurezas centrifugando 12.000rpm por 30 segundos.
Se efectuó la amplificación de la región espaciadora interna transcrita (internal transcribed spacer [ITS]) del ARN ribosomal por PCR utilizando los cebadores ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) (forward) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) (reverse) para identificar las levaduras44. Las bacterias se identificaron amplificando por PCR el ARN de la subunidad ribosomal 16s con los cebadores 27F (5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) y 1495r (5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)16. Los productos de PCR se revelaron en geles de agarosa al 0,8% y purificaron por precipitación con polietilenglicol (PEG 8000), con el posterior lavado con etanol al 70%. El producto final se resuspendió en H2O milliQ.
Una vez purificados, los productos de PCR fueron enviados a la empresa MACROGEN Inc. (Corea) para su secuenciación. Las secuencias obtenidas se analizaron manualmente con el programa MEGA X18 y se compararon con las secuencias equivalentes disponibles en bases de datos públicas (GenBank) utilizando la herramienta computacional BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). La identificación preliminar de los aislamientos obtenidos se realizó mediante el análisis de las secuencias de ADN obtenidas empleando el cebador forward para bacterias (27F) y levaduras (ITS1). Manualmente se extrajeron de las secuencias las regiones de buena calidad (Q≥16) con las cuales, finalmente, se llevaron a cabo los blastn. La asignación a nivel de especie se realizó únicamente en los casos en que hubo solo una especie con la identidad máxima y la similitud de aquella con especies de referencia fue ≥99%. En los casos donde la similitud fue inferior al 99% o el largo de las secuencias fue bajo (< 400 pb en levaduras, < 700 pb en bacterias), la identificación se hizo a nivel de género. Las secuencias obtenidas y curadas fueron depositas en el GenBank bajo los códigos de acceso PP218124:PP218132 y PP229526:PP229532.
Caracterización de las levaduras aisladas mediante ensayos bioquímicosScreening preliminar de levaduras en medios de cultivo especializadosDe la totalidad de levaduras contaminantes aisladas y preservadas en el banco de contaminantes, se seleccionaron representantes de cada grupo morfológico mediante ensayos de crecimiento de colonias con el uso de medios de cultivo microbiológicos especializados. Para ello, las levaduras fueron cultivadas en medio YPD agar 48h antes del experimento a 28°C. Se suspendió una colonia en 100μl de solución fisiológica al 0,9% (p/v) de NaCl. Para cada aislado se cultivaron gotas uniformes de 5μl en dos medios selectivos y un medio genérico, utilizado como control de carga. Estos ensayos fueron realizados por duplicado. Se utilizaron como medios selectivos agar almidón (AA) y medio LCSM25. Como medio de control de carga de levadura, se utilizó el medio genérico agar mosto. Como controles, se cultivaron dos cepas comerciales: Brettanomyces claussenii (White Labs, WLP645), asociada a contaminaciones en la industria cervecera, y Saccharomyces cerevisiae (White Labs, WLP 008), especie cervecera utilizada para la producción de cerveza Ale. Se observó el crecimiento y el aspecto de las colonias en los días 1, 2 y 5 de cultivo. Se consideraron relevantes y se seleccionaron aquellas levaduras que presentaron en LCSM crecimiento acelerado en los primeros dos días y las que generaron mayor biomasa en AA.
Ensayo de asimilación de almidónCon las cepas de levaduras contaminantes seleccionadas en el experimento detallado en la sección anterior se realizó un ensayo cuantitativo del potencial de crecimiento en medios selectivos para levaduras salvajes y de crecimiento en medio rico con almidón como única fuente de carbono. Además de las cepas control mencionadas en la sección anterior, se utilizó una cepa control adicional, S. cerevisiae var. diastaticus (PIBA-109, BLQ Weihenstephan), como ejemplar de un contaminante superatenuante de azúcares residuales en cerveza17. Se utilizaron 5 diferentes diluciones de células para cada cepa seleccionada. Para ello, se suspendieron colonias aisladas en solución fisiológica y se realizaron recuentos mediante cámara de Neubauer a fin de ajustar luego la concentración de las suspensiones madre a 2 x 107 cel/ml, para tener en 5μl un total de 1 x 105 células. De esta suspensión se realizaron 4 diluciones seriadas de 1:10 para obtener 1 x 104, 1 x 103, 1 x 102 y 1 x 101 células. Estos inóculos se sembraron en medio LCSM, AA y agar mosto para obtener el control de carga. Los ensayos se realizaron por duplicado. Se realizó un seguimiento a las 24 y 48h y se registró el crecimiento final de cada cepa.
Ensayo de fermentación a pequeña escala de mosto cerveceroEl mismo grupo de aislamientos fue utilizado para evaluar el potencial fermentativo del mosto cervecero en pequeña escala. Para ello, se colocaron 20ml de mosto estéril de densidad 10,4 °Brix en tubos de tipo Falcon estériles de 50ml de capacidad. La tasa de inóculo se determinó por recuentos en cámara de Neubauer, ajustando el número de células a 1 x 106 cel/ml x °Brix x volumen de mosto (ml). Las fermentaciones se incubaron a 25°C por 7 días, la densidad actual del mosto se midió cada 24h, para luego calcular el porcentaje de atenuación de azúcares. Como control se utilizaron las cepas B. claussenii (White Labs, WLP645), S. cerevisiae var. diastaticus (PIBA-109) y S. cerevisiae (White Labs, WLP008). Cada cepa se evaluó por duplicado.
ResultadosAnálisis microbiológicoPor microscopia, el 70% de las muestras evidenciaron la presencia de microorganismos. En el 53% de las muestras se detectaron levaduras, con el aspecto morfológico típico del género Saccharomyces en el 75% de los casos (fig. 1a). En el 66% del total de muestras analizadas se pudieron detectar bacterias. En el 40% de estas muestras se observaron bacterias con morfología de cocos, en el 10% bacterias con morfología de bacilos y en el 50% restante se observaron ambas morfologías (fig. 1b). En el 25% de las levaduras restantes, la morfología fue variable: se observaron desde células pequeñas ovales hasta células alargadas con formación de pseudohifas (fig. 1c).
Observaciones microscópicas de muestras de cerveza contaminadas. a) 40x; se observan células con aspecto similar al de las levaduras de cervezas de tipo Ale (Saccharomyces cerevisiae). b) 100x; como morfologías bacterianas, se observan cocos (flecha amarilla) y bacilos (flecha roja). c) 40x; se observan células de levaduras diferentes a las levaduras cerveceras. El color de la figura solo puede apreciarse en la versión electrónica.
En cuanto al crecimiento de microorganismos en medios de cultivo específicos para la industria cervecera, los resultados fueron los siguientes: se obtuvieron 16/30 muestras positivas (53%) en medio HLP. Dentro de estos resultados positivos, en el 50% de los casos se observaron solo morfologías del tipo Lactobacillus, 19% solo morfología de tipo Pediococcus, y en el 31% de los casos positivos restantes se observaron ambos tipos de morfologías. En el medio AMC, donde esperamos únicamente el crecimiento de bacterias, de las 30 muestras totales, en el 60% de los casos se observó crecimiento (fig. 2). Integrando los resultados de este medio con los del HLP, se observó una alta correspondencia en la detección de bacterias entre ambos medios. De las 18 muestras positivas en AMC, 13 (72%) también fueron positivas en HLP. En el medio LCSM, utilizado ampliamente en la industria cervecera para la detección de levaduras contaminantes, un 37% de las 30 muestras evaluadas arrojaron resultados negativos, es decir, no se observaron UFC/ml (fig. 2).
a) Resultado de recuentos en agar mosto con cicloheximida (AMC) y medio de sulfato de cobre de Lin (LCSM). Cada punto representa una muestra independiente, su tamaño está relacionado con el número de aislamientos obtenidos. No se graficaron las muestras con UFC/ml = 0. b) Diagrama de Venn donde se indica el número de muestras positivas para los medios de cultivos utilizados.
El pH medido estuvo en un intervalo de 3,71 a 4,61; con una media general de 4,18. Los azúcares reductores, en unidades de densidad específica (SG) y corregidos por el volumen de alcohol, oscilaron entre 1006 y 1015, con una media general de 1010. El color de las cervezas analizadas varió entre 3,8 y 12,7 SRM y en el 46,7% de las muestras analizadas se detectó turbidez.
Las medidas de amargor IBU variaron en el orden de 8,0 a 57,0. En conjunto con los valores de amargor proporcionados por las encuestas voluntarias, se pudo calcular el ΔIBU; los resultados se visualizan en la figura 3. Los puntos que se encuentran por encima del valor cero indican una sobreestimación del amargor calculado. Por el contrario, los que se encuentran por debajo de cero corresponden a muestras en las que se subestimó el amargor de la cerveza. No se logró encontrar una correlación entre el ΔIBU y los estilos declarados por las cervecerías.
Aislamiento e identificación molecular de microorganismos
De las 30 muestras, se logró aislar un total de 15 cepas bacterianas; estos microorganismos se obtuvieron de una colonia representativa y fueron estriados y purificados en medio no selectivo agar mosto sin cicloheximida. De acuerdo a la microscopia óptica, se clasificaron como bacilos (n=11) o cocos (n=4). En cuanto a las levaduras, se lograron 19 aislamientos, que también se obtuvieron de una colonia singular y se purificaron en el medio no selectivo para el crecimiento de levaduras YPD. Según su morfología en la observación microscópica, las levaduras se clasificaron en tres grupos: grupo 1 - morfología circular (n = 11), grupo 2 - morfología oval (n=5) y grupo 3 - morfología alargada (n = 3).
Utilizando cebadores específicos para regiones del ARN ribosomal se logró amplificar las secuencias de las 34 cepas de contaminantes microbianos. Los productos de amplificación de los aislamientos de levaduras tuvieron 800 pares de bases (grupos 1 y 2) o 400 pares de bases (grupo 3); los de los aislamientos bacterianos tuvieron 1500 pares de bases. En la tabla 1 se muestran los resultados del análisis en BLASTN de las secuencias obtenidas por amplificación de regiones ITS y codificantes de ARNr 16s de levaduras y bacterias, respectivamente. Frente a secuencias con porcentajes de cobertura e identidad superiores al 99% y un largo de secuencia de 400 pb (levaduras) o 700 pb (bacterias), se adjudicó al microorganismo aislado el género y la especie. Si las secuencias no cumplían con estos requisitos, solo se adjudicó el género.
Identificación de aislamientos microbianos provenientes de muestras de cerveza contaminadas a partir de secuencias de la región ITS (levaduras) y ARNr 16s (bacterias). Los porcentajes de cobertura y de identidad se obtuvieron usando la herramienta BLAST
| Aislamiento | Grupo | Género/especie | % Cobertura | % Identidad | Secuencia (pb) |
|---|---|---|---|---|---|
| YI.001 | 1 | Saccharomyces sp. | 98 | 100 | 211 |
| YI.002 | 1 | Saccharomyces cerevisiae | 100 | 99,4 | 691 |
| YI.003 | 2 | Saccharomyces sp. | 100 | 97 | 419 |
| YI.004 | 1 | Saccharomyces cerevisiae | 100 | 99,2 | 532 |
| YI.006 | 1 | Saccharomyces cerevisiae | 100 | 99,4 | 650 |
| YI.007 | 2 | Saccharomyces sp. | 100 | 96,9 | 302 |
| YI.010 | 3 | Pichia kudriavzevii | 100 | 99,8 | 455 |
| YI.011 | 1 | Saccharomyces sp. | 98 | 96,4 | 176 |
| YI.012 | 1 | Saccharomyces sp. | 100 | 98,4 | 236 |
| YI.013 | 1 | Saccharomyces cerevisiae | 100 | 99,8 | 446 |
| YI.014 | 2 | Saccharomyces cerevisiae | 100 | 97,4 | 401 |
| YI.021 | 3 | Candida orthopsilosis | 100 | 99,8 | 461 |
| YI.101 | 1 | Saccharomyces sp. | 100 | 86 | 111 |
| YI.103 | 1 | Lodderomyces elongisporus | 100 | 99,6 | 491 |
| BI.001 | Coco | Staphylococcus epidermidis | 100 | 99,9 | 739 |
| BI.002 | Coco | Staphylococcus epidermidis | 100 | 99,6 | 841 |
| BI.003 | Coco | Staphylococcus sp. | 100 | 99,3 | 419 |
| BI.004 | Bacilo | Acetobacter sp. | 96 | 98,3 | 188 |
| BI.005 | Bacilo | Acetobacter fabarum | 100 | 99,2 | 732 |
| BI.006 | Coco | Staphylococcus sp. | 99 | 98 | 101 |
| BI.007 | Bacilo | Acetobacter sp. | 99 | 99,8 | 455 |
| BI.008 | Bacilo | Acetobacter sp. | 98 | 99,5 | 201 |
| BI.009 | Bacilo | Acetobacter sp. | 100 | 99 | 97 |
| BI.010 | Coco | Staphylococcus epidermidis | 100 | 99,8 | 981 |
| BI.011 | Bacilo | Acetobacter sp. | 98 | 97,6 | 221 |
| BI.033 | Bacilo | Acetobacter indonesiensis | 100 | 99,4 | 701 |
Primero se realizó un screening con los 19 aislamientos de levaduras, en donde se observó el crecimiento diferencial en los medios de cultivo LCSM y AA. Pudimos notar una marcada diferencia en las levaduras del grupo 3, que presentaron un crecimiento excesivo en ambos medios de cultivo (tabla S2). A partir de esta información, se seleccionaron 7 aislamientos para realizaron otros ensayos, 2 de cada grupo morfológico más un tercer aislamiento del Grupo 3).
En la figura 4 podemos notar el crecimiento diferencial de los aislamientos seleccionados en los medios de cultivo mencionados, así como el de los controles PIBA-109 (levadura contaminante, S. cerevisiae var. diastaticus), WLP008 (levadura cervecera, S. cerevisiae) y WLP645 (levadura contaminante no sacaromicética, B. claussenii). La cepa control WLP008 mostró crecimiento solo en agar mosto. En cambio, las cepas PIBA-109 y WLP645 mostraron crecimiento en AA y LCSM.
Las cepas YI.006 e YI.101, del Grupo 1 mostraron crecimiento en las inoculaciones de 105 hasta 101 células en AA. El crecimiento fue leve y similar al crecimiento al control PIBA-109. En medio LCSM, se observó un crecimiento aún mayor, similar a lo observado en el control de carga, en el medio agar mosto. Dentro del Grupo 2, se observaron diferencias dentro del mismo grupo. En el medio AA, las cepas YI.015 e YI.016 mostraron un crecimiento similar al del control PIBA-109, como también se observó en el Grupo 1. Sin embargo, en el medio LCSM no hubo crecimiento de la cepa YI.015 a excepción de la inoculación con 105 células, en donde se observa un crecimiento leve en «spots». Este comportamiento coincide con el observado en el screening preliminar, en donde se marcó «sp» en LCSM (tabla S2). Consistentemente, YI.016 mostró crecimiento en este medio. Todas las cepas del Grupo 3 mostraron comportamientos similares. Las cepas YI.010, YI.021 e YI.102 mostraron un gran crecimiento en AA, mayor al observado en el control WLP645. En el medio LCSM, existió una leve diferencia para la inoculación con 101 células entre las cepas. Comparando con el control de carga, las cepas YI.010 e YI.021 mostraron un crecimiento menor, mientras que la cepa YI.102 mantuvo un alto crecimiento.
A fin de estudiar los parámetros cinéticos sobre el consumo de azúcares de las levaduras aisladas en este trabajo, se realizaron microfermentaciones en escala de 20ml. Pasados los 7 días de fermentación, se calculó el perfil de atenuación de azúcares de todas las cepas de interés seleccionadas (fig. 5). Se obtuvieron resultados esperados para los controles utilizados en este ensayo. El control de WLP645 no mostró consumo de azúcares, ya que el género Brettanomyces tiene un proceso fermentativo más lento que lo esperado para Saccharomyces. Se observó una densidad final de 5 °Brix aproximadamente para el control WLP008 y una densidad final menor de 4 °Brix para la variante S.cerevisiae var. diastaticus (PIBA-109).
Cinética de fermentación de los aislamientos seleccionados en mosto de cerveza de 10,4 °Brix. Las cepas PIBA-109, WLP008 y WLP645 fueron utilizadas como control. Los grupos morfológicos G1, G2 y G3 se muestran en rojo, verde y azul, respectivamente. El color de la figura solo puede apreciarse en la versión electrónica.
Los resultados arrojan nuevamente comportamientos distintivos para las cepas que integran los Grupos 1 y 2. Dentro del Grupo 2, y a partir del segundo día, el comportamiento de la cepa YI.101 se asemeja al comportamiento del control de la variante diastaticus, mientras que la cepa YI.006 tiene un comportamiento fermentativo similar al del control WLP008, con una densidad final un poco más alta de 6 °Brix en promedio. Para las cepas del Grupo 1, también se logró observar una diferenciación similar a la del Grupo 2: la cepa YI.015 tiene un comportamiento similar a la variante diastaticus, mientras que la cepa YI.016 se asemeja al control cervecero WLP008. Todas las cepas del grupo 3 presentaron un comportamiento similar, con poco o nulo consumo de azúcares luego de los 7 días.
DiscusiónEste trabajo representa el primer estudio sobre la incidencia de microorganismos deteriorantes en la industria cervecera artesanal en la Ciudad Autónoma de Buenos Aires y GBA (Gran Buenos Aires), un sector productivo en pleno auge, que entre el 2013 y 2019 evidenció un 40% de crecimiento anual en promedio (comunicación personal, CCAA). Las muestras utilizadas en este estudio abarcan un amplio espectro de establecimientos cerveceros, con una capacidad productiva anual, que varió entre 50.000 hasta 850.000 litros (datos del año 2018). Todos los productores encuestados afirmaron realizar en el equipamiento de sus fábricas lavados con detergentes alcalinos y sanitización con ácido peracético. Estas prácticas ayudan a erradicar microorganismos de los equipos para la elaboración del mosto, fermentación, acondicionamiento y almacenamiento de la cerveza5. Hasta el momento, pocas fábricas utilizan vapor para la sanitización de sus bloques de cocción y barriles, aunque es una práctica que está tomando relevancia en el país con la adaptación de calderas al proceso productivo.
Es importante destacar que ninguno de los establecimientos que participaron del estudio cuentan con sistemas de pasteurización para sus cervezas. Esta práctica ha ganado popularidad en el sector artesanal debido a los cambios en los sistemas de venta y distribución que surgieron con la pandemia de COVID-19. Las cervecerías comenzaron a fraccionar sus productos en latas y/o botellas, permitiendo otra lógica de consumo sobre la cual no poseen un control total al salir de sus establecimientos. Por lo tanto, la pasteurización del producto terminado para eliminar microorganismos deteriorantes de la cerveza sumó adeptos en los últimos años47. Sin embargo, tener bajos niveles de microorganismos contaminantes previo a la pasteurización es fundamental para disminuir las unidades de pasteurización que impactan organolépticamente sobre la cerveza3,27.
Hasta el momento de realizar este estudio, solo se contaba con los datos obtenidos por Latorre y equipo, quienes analizaron los microorganismos contaminantes en cervezas embotelladas de la región patagónica de Argentina22. Los mismos autores luego ampliaron sus estudios a Córdoba, Santa Fe y Costa Atlántica, tres de los polos cerveceros más importantes del país21. Este trabajo aporta información sobre la región productiva faltante, completando así los principales polos cerveceros de la Argentina. Los datos de incidencia de contaminantes obtenidos en este estudio para muestras de CABA y GBA (66,7%) se condicen con lo encontrado en la región patagónica, donde alrededor de dos tercios de las muestras revelaron presencia de microorganismos22. Sin embargo, el promedio de UFC/ml fue menor en CABA y GBA que en la región patagónica: bacterias, 8,9 x 102 vs. 7,3 x 105 UFC/ml; levaduras contaminantes, 2,5 x 102 vs. 2,7 x 103 UFC/ml. Esto puede deberse a las diferencias en el tipo de muestras analizadas, ya que en el estudio realizado en Patagonia las muestras se tomaron de botellas y en este trabajo directamente de barriles. Los sistemas de envasado de cerveza sean por enlatado o embotellado implican una manipulación adicional del producto, que aumenta la probabilidad de ingreso de microorganismos contaminantes, principalmente de aquellos que forman biofilms41.
El medio HLP para la detección de bacterias ácido lácticas de los géneros Lactobacillus y Pediococcus es económico y requiere de muy bajo equipamiento para su aplicación en fábrica, por lo que es un gran aliado de las cervecerías artesanales10. Usando este medio, alrededor de la mitad de las muestras analizadas (53%) fueron positivas para estos microorganismos, lo que guarda relación con el dato del 45,3% del estudio realizado en cervezas embotelladas de Patagonia22. Estos datos difieren de los obtenidos en otras regiones en donde la industria de cerveza artesanal tiene mayor tiempo de desarrollo, como son los casos de Estados Unidos (15%), Australia (21%) e Italia (27%)30,43.
La presencia de estas bacterias ácido lácticas en las cervecerías no es inusual, ya que poseen una larga historia asociada a la elaboración de cerveza32,37. De hecho, es normal que se encuentren en ciertos estilos de cerveza, regionales o históricos, los cuales están ganando popularidad en el mundo de las cervezas artesanales. Algunos ejemplos de cervezas donde podemos encontrar Lactobacillus son las Berliner Weisse o Gose alemanas, en American o Catharina sours, así como en cervezas de fermentación espontánea, aunque en estas últimas es más frecuente la presencia de Pediococcus7; sin embargo, no deberían estar presentes en el producto terminado de cervezas convencionales, como las analizadas en este estudio. Pediococcus suele encontrarse en ciertas plantas y frutas y forma parte del microbioma humano37. Otra fuente posible de Lactobacillus es la malta de cebada, que normalmente posee una carga cercana a 104 UFC/g6, por lo que es importante separar los sectores de molienda del resto de los procesos de elaboración19. Cabe señalar que todas las fábricas muestreadas en este trabajo tenían implementada dicha compartimentalización, por lo que las contaminaciones con Lactobacillus observadas pueden deberse a otros factores o a una combinación de los mencionados, como una insuficiente limpieza y sanitización del equipamiento y de los espacios de fabricación.
Si bien no pudimos asociar ninguna variable fisicoquímica al número de contaminantes en las cervezas, ni siquiera en el caso del pH, como se describió previamente22, se encontraron diferencias en algunos parámetros entre las mediciones informadas por el productor y las determinaciones hechas en el laboratorio. En el caso de las unidades de amargor, encontramos una tendencia a sobreestimar dicho parámetro, lo que puede afectar el perfil organoléptico de las cervezas y la barrera de tolerancia para el crecimiento de ciertos microorganismos contaminantes. Un ejemplo son las bacterias del género Lactobacillus: estas lograron adaptarse a cervezas con alto IBU a través de la incorporación de los plásmidos de resistencia horA y horC40. Asimismo en China, Yu et al.48 aislaron a partir de botellas de cerveza artesanal una cepa de Staphylococcus xylosus con la capacidad de crecer en altas concentraciones de iso-α-ácidos (>200μM). En el mismo sentido, algunas cepas del género Lactobacillus han adaptado su metabolismo para crecer en condiciones de pH subóptimas para sus respectivas especies39. Es importante destacar que estos errores en la medición o estimación de ciertos parámetros, que tienen influencia en la actividad microbiana, pueden hacer que el producto se vuelva más propenso a ser afectado por microorganismos deteriorantes. La tecnificación y profesionalización del sector cervecero artesanal es fundamental para lograr precisión al medir parámetros fisicoquímicos y evitar grandes pérdidas económicas por eventos de contaminación, así como para favorecer el crecimiento sostenible de la actividad. Diversos proyectos de asistencia técnica se vienen realizando desde el sector científico-académico con el fin de mejorar estos aspectos en las cervecerías artesanales argentinas8.
Los aislamientos logrados a partir del medio agar mosto con cicloheximida pertenecen a los géneros Staphylococcus y Acetobacter. Si bien se cree que bacterias patógenas como Staphylococcus aureus no pueden crecer en la cerveza12,48, en los últimos años y con el auge de distintas cervezas regionales, se han aislado especies del género adaptadas a este medio, como Staphylococcus xylosus, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus12,26,48. En este estudio, los aislamientos que se pudieron identificar a nivel de especie correspondieron a S. epidermidis, especie que, debido a su capacidad de formar biofilms en implantes médicos, es considerada un patógeno oportunista31. Haakensen y Ziola13 encontraron el gen de resistencia horA en aislamientos ambientales de esta especie, el que le podría otorgar tolerancia a compuestos del lúpulo y, por ende, permitirle desarrollar en la cerveza.
El género Acetobacter se encuentra fuertemente relacionado con la elaboración de cerveza y es uno de los principales contaminantes34. Estas bacterias gram negativas poseen una considerable capacidad de tolerar alcohol (>16% v/v), aunque su condición aerobia hace que su aparición en la cerveza sea en focos puntuales, como puede ser la formación de biofilms en sistemas de servicio de cerveza en bares5,15. Acetobacter fabarum ha sido reportada en muestras provenientes de sistemas de servicio de cerveza en Inglaterra15, en una muestra proveniente de fermentación en coolship en Estados Unidos y en mosto de cervezas lámbicas en Bélgica35,45. Asimismo, en Argentina ha sido aislada de botellas de cerveza provenientes de la región patagónica22. En cuanto a Acetobacter indonesiensis, esta es una especie que no es considerada un contaminante tan común de cervezas, sin embargo, hay algunos registros en Bélgica, donde se la aisló de cervezas embotelladas de bajo contenido alcohólico (1,5% v/v)45. Acetobacter ha perdido relevancia en los eventos de contaminación como consecuencia de una menor incorporación de oxígeno durante el proceso de envasado34. Estos hallazgos y los reportados en estudios anteriores21,22 son de interés, ya que la aparición de este género en barriles y botellas de cervecerías argentinas es un indicador de que, probablemente, los procesos de envasado no sean lo suficientemente rigurosos con respecto a la incorporación de oxígeno21. Esta condición no solo puede predisponer a la aparición de estos contaminantes, sino que tiene un efecto deteriorante sobre las características organolépticas del producto; es por ello que el control de calidad enfocado en disminuir la incorporación de oxígeno es fundamental para mejorar la calidad del producto terminado.
En este estudio fue posible aislar levaduras pertenecientes a los géneros Saccharomyces, Lodderomyces, Candida y Pichia empleando el medio LCSM. La alta frecuencia de aislamiento de levaduras sacaromicéticas (84% del total de aislamientos) coincide con lo reportado en la literatura, ya que el mayor contaminante para la industria es S. cerevisiae var. diastaticus17,23,29. Estas levaduras no solo poseen la capacidad de un rápido consumo de los azúcares del mosto, sino que su particularidad de consumir dextrinas las posiciona como el contaminante de mayor riesgo para la industria17,23. El consumo de dextrinas está asociado al número de copias del gen STA1, cuya actividad está regulada por una deleción específica en su región promotora17. La diversidad genética observada entre cepas de la variedad diastaticus repercute fenotípicamente en la velocidad de consumo de dichas dextrinas17. Dentro de los aislamientos obtenidos en este trabajo, YI.015 y YI.101 mostraron un fenotipo similar a la cepa de referencia PIBA-109 (fig. 5) y lograron atenuar un 98% de los azúcares del mosto cervecero. La detección temprana de estas variantes diastáticas es sumamente importante, ya que de exponer la cerveza a condiciones en las que aquellas puedan proliferar (como alta concentración de oxígeno disuelto o alta temperatura), el consumo de azúcares residuales no solo afectará la percepción organoléptica del producto, sino que podría generar una sobreproducción de CO2, con el consecuente riesgo de explosión de latas o botellas4,29.
No se encontraron registros de la presencia de Lodderomyces elongisporus en muestras provenientes de cerveza o del ambiente cervecero. Sin embargo, esta especie ha sido encontrada en otras bebidas fermentadas, como la chicha9 y el vino33. Las células de L. elongisporus se asemejan a las de S. cerevisiae; es por esto que se las asignó al G1 en la agrupación morfológica. No obstante, la forma elipsoidal de sus ascosporas la diferencian de las levaduras sacaromicéticas20. Sí hay registros de Candida orthopsilosis en agua de lavado en cervecerías de producción de cerveza Lager en Tailandia, así como en fermentaciones de vino de arroz en China42. El género Pichia se ha asociado a fermentaciones espontáneas de cerveza en numerosas oportunidades5,36; Pichia kudriavzevii, en particular, es frecuente en la producción de cervezas lámbicas en Bélgica36. Las especies no sacaromicéticas aisladas en este trabajo no fueron capaces de consumir la maltosa del mosto cervecero, en coincidencia con lo registrado en informes anteriores20. Dado que este es el principal azúcar que compone el mosto de cerveza, cualquier levadura que pudiese consumirlo sería un directo competidor de las levaduras cerveceras (del género Saccharomyces). Sin embargo, estos microorganismos podrían afectar al mosto en sus primeras h de fermentación cuando en aquel hay glucosa o sacarosa, produciendo ciertos off-flavors que podrían permanecer en la cerveza terminada, pero el hecho de carecer de la capacidad de consumir maltosa los convierte en contaminantes de bajo riesgo.
ConclusionesLos resultados de este trabajo permiten completar la relevancia de la incidencia de microorganismos deteriorantes en los principales polos cerveceros de la Argentina. Dos de cada tres cervecerías artesanales de CABA y Gran Buenos Aires mostraron presencia de microorganismos indeseados para la industria, lo que evidencia que aún hay deficiencias en la implementación de procesos efectivos de control de calidad. Mayormente, se aislaron microorganismos con antecedentes como contaminantes cerveceros, con la excepción de la levadura L. elongisporus. La correcta identificación de bacterias y levaduras contaminantes para la industria es de vital importancia a la hora de generar herramientas de detección temprana para evitar que estos microorganismos puedan dañar organolépticamente las cervezas artesanales. Los microorganismos obtenidos se incorporaron al banco de contaminantes del Instituto Andino Patagónico de Tecnologías Biológicas y Geoambientales (IPATEC), actualmente la más grande de Sudamérica. Los resultados de esta investigación permiten establecer las bases para un mejor entendimiento de la incidencia microbiana en las cervezas artesanales del país y en el sector cervecero artesanal en general, contribuyendo a la mejora de los procesos y controles y, como fin último, a la calidad de los productos elaborados. Además, provee información e insumos (aislamientos) valiosos para la optimización de los procesos de pasteurizado, una práctica cada vez más difundida entre los productores cerveceros artesanales.
FinanciaciónEste estudio fue financiado con fondos provenientes del PICT-2017-0854 (P.S.A) y financiado parcialmente por subsidios de la UNComahue (04/B247), ANPCyT (PICT-2020-226) y CONICET (PIP-11220200102948CO).
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecemos a los productores de cerveza artesanal de CABA y Gran Buenos Aires, quienes nos abrieron las puertas de sus emprendimientos y nos ayudaron a realizar este estudio. A la Dra. Mailén Latorre por su revisión y consejos sobre el manuscrito.
