INTRODUCCION
La proteína p53 es una fosfoproteína nuclear, descubierta por Lane et al en 1979 por estudios en células transformadas por infección con SV40, en las cuales se precipitaba el antígeno T grande formando un complejo con una proteína celular de 53-kDa1. Posteriormente esta fosfoproteína p53 se encontró asociada con la proteína E1b del adenovirus tipo 52 y con la proteína E6 de los papilomavirus tipo 16 y 18 que también están ligados a la proteína p533; sugiriendo que estos virus ADN tenían como objetivo común en la célula la proteína p53.
Con anticuerpos contra la proteína p53 se observó que esta se acumula en el núcleo de varias líneas celulares transformadas: sarcoma murino inducido químicamente, leucemia inducida por virus, o fibroblastos transformados; pero esta proteína no se encuentra en diferentes tipos de células normales embrionarias y del adulto4. Su acumulación específica en el núcleo de muchas células tumorales o transformadas sugería que podía desempeñar un papel importante en la transformación celular4-6.
Oren y Levine (1983) con inmunoprecipitación de los polisomas durante la traducción les permitió aislar un fragmento de 300-bp que corresponde al ADNc de la p53 del ratón y posteriormente fue aislado y secuenciado7. Benchimole et al en 1985 han identificado el gen que está localizado en el brazo corto del cromosoma 178. Nigro et al en 1989 determinaron que esta fosfoproteína contiene 393 aminoácidos9. En 1989 comenzó a surgir el interés por la p53 al aparecer publicaciones indicando que este gen está alterado en cánceres humanos5,6.
LA p53 Y EL CICLO CELULAR
La p53 no es detectable en células normales por su corta vida media de 20 min, mientras la p53 mutada tiene una vida media de aproximadamente 24 h10,11. La localización celular de la proteína p53 varía durante el ciclo celular: durante la fase G1 se encuentra en el citoplasma, luego entra en el núcleo en la transición G1/S allí permanece hasta el final de la fase G2/M12. Como norma, en células transformadas o tumorales, la proteína p53 es estrictamente nuclear, pero se han observado algunas excepciones5.
North (1991) describía el cáncer como una enfermedad del ciclo celular13. Varias observaciones sugieren que la proteína p53 es imprescindible para la progresión del ciclo celular normal. El bloqueo de los ciclos celulares tiene lugar entre G1 y la fase S, exactamente al final de G1 cerca del punto de restricción (R-point, punto R). La p53 no inhibe el paso G0 a G1, pero si el paso de G1 a la fase S. Kastan et al (1991) demostraron que la pérdida de la actividad supresora tumoral de la p53 se asocia con una incapacidad para detener la transición desde G1 a S en el ciclo celular en las células que han acumulado daño del ADN14. Kern et al (1991) y Scharer e Iggo (1992) han demostrado que la p53 normal, pero no la mutante, se liga al ADN y actúa como un activador transcripcional15,16. Milner y Metcalf (1991) han resaltado que la p53 mutada parece actuar de un modo negativo dominante, formando complejos con la p53 normal que bloquea su función normal17.
Donehover et al (1992) consiguieron ratones transgénicos, con deleciones de los dos alelos de p53, lo cual generó muchas sorpresas ya que estos ratones p53/p53 son completamente viables y fértiles, y no se han observado malformaciones embrionarias. El rasgo fenotípico mayor es que aparece cáncer con gran frecuencia y precocidad: en el 75 % de los animales a los 6 meses y en el 100 % a los 10 meses. Los animales que son heterozigóticos p53+/p53 los ratones también desarrollan cáncer, pero sólo el 30 % de los animales y después de los 15 meses. La p53 no es esencial en la función celular normal, pero su inactivación es un factor esencial en el desarrollo de algunos tipos de neoplasia18.
LA p53, EL DAÑO DEL ADN Y LA ESTABILIDAD GENÉTICA
Maltzman et al (1984) demostraron que la irradiación UV de células normales del ratón induce estabilización de la p53 in vivo19 y Kastan et al (1991) confirmaron estos resultados con el uso de radiaciones gamma que también producen el mismo efecto y que la acumulación de p53 produce un bloqueo transitorio del ciclo celular en la fase G1, justo antes de iniciar la duplicación del ADN14. Se cree que este bloqueo de la división celular, a continuación del daño del ADN, da tiempo a la célula para inducir una respuesta para reparar las lesiones. Se observó que las células con expresión de una p53 mutada no presentan este fenómeno, estas células no dejan de dividirse después del daño del ADN5,6,12.
Estos estudios conducen a la conclusión de que la p53 ayuda a preservar la integridad genética de la célula, la p53 actuaría como una especie de "semáforo" que induciría una detención de la división celular para dar tiempo a la célula para reparar el daño del ADN. Por esta cualidad, la p53 fue denominada por Lane (1992) guardián del genoma humano12. Si la célula no es capaz de reparar el daño del ADN se supone que la p53 induciría la muerte celular por apoptosis. Las células tumorales que contienen p53 mutada no son capaces de mantener su integridad genética, porque no reciben la señal de detención de la división celular, dando por resultado una célula cuyo genoma es menos estable y que acumulará varias mutaciones dando lugar a clones con mayor malignidad.
Investigando las diferencias entre la p53 natural y la p53 mutada, se descubrió un gen que es específicamente inducido por la p53 natural: el gen WAF 1, el cual codifica la proteína p21. La sobreexpresión de la proteína p21 en varios tipos celulares induce detención del crecimiento en la fase G1 que es dependiente de la p53 natural. Esta proteína p21 también ha sido identificada por diferentes grupos como siendo capaz de asociarse específicamente con la cinasa cíclin-dependiente (cdk2) e inhibir la actividad cinasa de los complejos cdk2-ciclina. La inducción de lesiones del ADN en células con p53 natural causa sobreexpresión de WAF1 > ARN > proteína; pero esto no se observa en presencia de p53 mutada20.
Usando anticuerpos específicos para la proteína p21 se podría demostrar que la expresión de esta proteína es responsable de la pérdida de actividad del complejo cdk2-ciclín E. Este resultado es una buena demostración de que la p53 interviene en un estadio final de la fase G1, en el momento de la transición G1/S5,6,20.
LA p53 Y LA DIFERENCIACION
La p53 tiene un papel controvertido en el desarrollo embrionario precoz y durante la diferenciación. La p53 disminuye en la fase del desarrollo máximo, durante la parte media de la gestación que es la fase de máximo progreso en la diferenciación5,6. Los estudios de Donehover et al (1992) con ratones transgénicos observaron un desarrollo embrionario normal en ratones p53/p5318.
LA p53 COMO GEN: ESTRUCTURA Y CONSERVACION
La proteína p53 puede ser dividida en tres regiones: a) aminoterminal que contiene un gran número de residuos básicos y hay un gran número de prolinas; b) carboxiterminal que es muy hidrofílico y contiene muchos residuos cargados, y c) la región central de la proteína que contiene varias regiones muy hidrofóbicas y pocos aminoácidos cargados. La proteína p53 de diversas procedencias muestra una homología no uniformemente distribuida y hay cinco bloques bien conservados durante la evolución: cuatro bloques están en la región central y el restante se encuentra localizado en el aminoterminal. La presencia de cuatro bloques en la región central muestra la gran importancia de la misma; es la región de contacto con el ADN5.
ONCOGÉN O ANTIONCOGÉN
Los experimentos que muestran que la p53 y el oncogén activado H-RAS podían cooperar para producir focos transformados llevó a clasificar la p53 como un oncogén nuclear durante algún tiempo; pero sólo la p53 mutada coopera con el oncogén activado H-RAS y no lo hace la p53 natural5,6. Otros estudios sugirieron que la p53 pertenece a los genes supresores de tumores, generalmente considerados como reguladores negativos del crecimiento celular, con las siguientes características: a) pérdida de la función, ocurriendo por inactivación de los dos alelos del gen; b) la reintroducción del gen supresor en el tumor puede abolir el poder carcinógeno de aquella célula, y c) son genes recesivos y están implicados en cánceres hereditarios5.
LA PROTEINA p53 Y LOS CANCERES HUMANOS
La proteína p53 está inactivada en muchos cánceres humanos. El análisis genético del cáncer colorrectal revela una tasa muy alta de pérdida heterozigótica del brazo corto del cromosoma 17, que contiene el gen de la proteína p53. El análisis con la PCR y la secuenciación del alelo restante de p53 muestra que éste contiene a menudo una "point mutation" (Baker et al, 1989)21.
Los cánceres hereditarios han merecido especial atención referente a la p53. El síndrome de Li-Fraumeni que se presenta con un amplio espectro de tumores malignos: osteosarcomas, cánceres de mama, sarcomas de partes blandas y leucemias que aparecen a edades tempranas, en el 50 % de los individuos antes de los 30 años y en el 90 % antes de los 70 años. Se han observado mutaciones en la p53 que afectan a toda la línea germinal en varias familias con este síndrome22-24.
Lemoine (1994) señala que la mutación de la p53 caracteriza una forma altamente agresiva de cáncer de mama, asociada con un pobre pronóstico tanto en los casos con ganglios axilares positivos o negativos25.
En el cáncer de próstata que tanta homología tiene con el de mama, Voeller et al (1994) observaron una baja tasa de mutación de la p5326.
Por todas estas razones se considera a la p53 como un gen supresor del cáncer y que junto con el oncogén RB son los genes supresores por excelencia. La p53 tiene aspectos particulares: las mutaciones (> 95 %) son "point mutations" que producen una proteína mutante que en todos los casos ha perdido su actividad transactivacional5.
Se considera que hay tres clases de mutaciones de p53: a) mutaciones nulas que inactivan totalmente la p53; pero no interfieren en la transformación; b) mutaciones dominantes negativas con una p53 totalmente inactiva que todavía es capaz de interferir con la p53 natural, y c) mutaciones dominantes positivas donde la función normal de la p53 está alterada y la p53 mutante adquiere una actividad oncogénica que está directamente implicada en la transformación maligna5,6.
Horak et al (1991) comunicaron la existencia de sobreexpresión de la proteína p53 en > 50 % de los cánceres de mama27.
¿MUTACIONES O VARIACIONES?
Hay que saber si los cambios son deletéreos e inactivan la p53 funcionalmente. Hay varias observaciones para probar que son verdaderas mutaciones adquiridas: a) las mutaciones están presentes sólo en el tejido tumoral y ausentes en los tejidos normales del mismo enfermo; b) el análisis secuencial del gen p53 de muchos tejidos normales muestra que hay pocos polimorfismos en el gen humano p53; c) estas alteraciones se encuentran sólo en los bloques altamente conservados de la p53, en las regiones funcionalmente importantes de la p53, y d) el análisis de las propiedades de varias p53 mutantes, frecuentemente encontradas en cánceres humanos, muestra que han perdido su actividad transactivacional. Sin embargo, un estudio más reciente de más de 20 mutantes indica que algunas de las mutaciones de baja frecuencia no alteran ninguna de las propiedades de la proteína p53 (transactivación o inhibición del crecimiento).
MODIFICACIONES EPIGENÉTICAS DE LA p53
Hay dos ejemplos de alteraciones en la p53 que no implican una alteración directa del propio gen de la p53: a) el gen MDM2 está amplificado en los sarcomas humanos y el MDM2 es capaz de inactivar la función transactivadora de la p53; este fenómeno se confirmó en sarcomas humanos y en el 10 % de los tumores cerebrales (glioblastomas y astrocitomas), y b) algo controvertido es el antagonismo entre la infección por HPV (papiloma virus humano) y la función de la p53 por medio de la proteína E65,6.
LAS TÉCNICAS ANALITICAS DEL GEN DE LA p53
Análisis molecular
La PCR seguida de análisis secuencial de las bases permiten el estudio directo de la naturaleza de la mutación en el gen, pero la mutación de un solo nucleótido de los 23.000 que conforman el gen, complica el hallazgo de la mutación en un caso concreto. Pero para ser efectiva esta técnica requiere ser desarrollada más ampliamente.
Análisis inmunohistoquímico
Una de las propiedades más significativas de las proteínas p53 mutantes es el alargamiento de su vida media. En las células normales, la p53 es indetectable por tener una vida media extremadamente corta (15-20 min). En células transformadas, la proteína p53 mutada es mucho más estable, con una vida media de 24 h y se acumula en el núcleo10,11. Esta acumulación nuclear de la p53 mutada permite su detección por métodos histoquímicos. Este procedimiento se ha empleado en diversos tipos de cáncer con una buena correlación entre el análisis molecular (presencia de una mutación) y el análisis inmunohistoquímico (sobreexpresión de la proteína mutante).
La ventaja de este procedimiento es que puede ser realizado de un modo rutinario en los laboratorios de histología, pero tiene el inconveniente de que algunas mutaciones pueden abolir la expresión de la p53 ("nonsense mutations", inserciones, deleciones, mutaciones de señal), no producen la proteína y como consecuencia dan un resultado negativo (5-10 % de los casos). Por otra parte, los tumores pueden sobreexpresar la p53 en la completa ausencia de mutaciones en cualquier parte del gen. Esta hiperexpresión es específica de las células tumorales y no afecta a los tejidos normales, sería una alteración desconocida de la p53. Los problemas de evaluación de la hiperexpresión de p53 en los tumores malignos han sido revisados por Dowell et al (1994)28.
Se han desarrollado nuevos anticuerpos monoclonales frente a p53 humana que pueden utilizarse incluso para realizar estudios histoquímicos con tejidos antiguos incluidos en parafina5.
Análisis serológico
Ya Davidoff en 1992 observó que el 23 % de las enfermas con cáncer de mama tenían anticuerpos anti-p53 circulantes en su suero, si había sobreexpresión de la p53,y no había anticuerpos anti-p53 circulantes en los casos con p53 normal o baja29.
Generalmente en el cáncer de pulmón, con una tasa alta de mutaciones de p53 hay una buena correlación entre la presencia de anticuerpos circulantes y la de alteraciones de la p53, la frecuencia de estos anticuerpos anti-p53 es alta (24 %). La seropositividad es muy baja en el cáncer de próstata o en los mesoteliomas con valores de p53 mutada muy bajos. En estudios multifactoriales se demostró una correlación muy buena entre la presencia de anticuerpos anti-p53, sobreexpresión de la proteína mutada en el tumor y la presencia de una mutación en el gen. Un análisis detallado de estos anticuerpos indica que reconocen tanto la p53 normal como la mutada5,6.
Regidor et al (1996) en 61 casos recidivantes de cáncer de mama observaron la presencia de autoanticuerpos p53 en el 14,5 % de los casos; pero concluyen que este parámetro no puede utilizarse como un factor pronóstico, ya que el intervalo libre de enfermedad no difiere entre los casos positivos y los negativos30. Mayerhofer et al (1999) en un estudio en casos de cáncer de vulva, encuentran los autoanticuerpos en el 10 % de las enfermas y no había ninguna correlación con el pronóstico31.
El análisis serológico tiene las siguientes ventajas: a) simplicidad del análisis por la técnica ELISA32; b) no se necesita tejido tumoral; c) la posibilidad de seguir la suerte de los anticuerpos durante el tratamiento del enfermo, y d) determinarla en enfermas con metástasis inasequibles.
El Laboratorio CALBIOCHEM, Oncogene Research Product, desarrolló una técnica de ELISA para la determinación de la p53 mutada, basándose en que la p53 natural y la mutada pueden distinguirse sobre la base de la reactividad diferencial con anticuerpos monoclonales10. El test ELISA es un enzimoinmunoensayo en sándwich que emplea anticuerpos monoclonales del ratón y policlonales del cobaya. Los anticuerpos monoclonales son específicos para la mayoría de las proteínas p53 mutadas. No presenta reacciones cruzadas con otras proteínas plasmáticas o celulares. Tiene una gran sensibilidad y permite detectar pequeñas cantidades (0,05 ng/ml) de p53 mutada33. Es una técnica que necesita más trabajos de investigación para su homologación clínica; pero es muy prometedora34. El Grupo de Investigación Oncológica hemos realizado estudios con esta técnica en enfermas de cáncer de mama en remisión clínica prolongada y en enfermas con una recidiva en actividad clínica y los resultados son coherentes con todo lo publicado hasta la fecha sobre p53 en el cáncer de mama35.
SIGNIFICACION CLINICA DE LA p53 MUTADA
Es posible correlacionar las alteraciones del gen p53 con parámetros diagnósticos o pronósticos y aplicarlos para escoger un plan terapéutico. Los casos de cáncer de mama con p53 negativa, es decir, con ausencia de p53 mutada tienen mejor pronóstico. Y la presencia de p53 positiva significa la presencia de proteína mutada, la cual se sobreexpresa acumula en los tejidos por tener una vida media más larga que la natural.
El cáncer de mama tiene una expresividad clínica y un pronóstico diferente en cada país y del mismo modo la p53 mutada en el cáncer de mama varía de un país a otro. Meng et al (1999) observaron que 178 enfermas españolas de cáncer de mama con ganglios axilares negativos, 59 % presentaban una o varias mutaciones; frecuencia que es muy diferente de la observada en poblaciones de Estados Unidos y norte de Europa36.
Cattoreti et al (1988) ya observaron una sobreexpresión de la p53 en enfermas con cáncer de mama de mal pronóstico (RE negativos y grado III)37. Thor et al (1992) y Barnes et al (1993) concluyeron que la alteración del gen p53 podía ser considerada como un nuevo marcador pronóstico del cáncer de mama, independiente, asociado con una corta supervivencia38,39.
Allred et al (1993) presentaron los resultados más prometedores para la clínica, al analizar una serie de 700 casos de cáncer de mama N0 (ganglios axilares negativos) y el 52 % (362/700) de las enfermas tenían una alteración de la p53 (histoquímica). Estas mismas enfermas con mutaciones de la p53 tenían un intervalo libre de enfermedad más corto que los casos con p53 normal. Si se puede confirmar en estudios posteriores este trabajo sentaría las bases de un uso clínico importante en unos casos de cáncer de mama que son muy interesantes clínicamente; estos casos son curables en la mayoría de las ocasiones y puede extremarse la vigilancia en los casos con p53 mutada. Aún es muy pronto para poder decir que pueda convertirse en un marcador que nos permita decidir dar o no quimioterapia adyuvante40. Allred et al (1992) habían realizado un análisis multivariable de 544 cánceres de mama congelados de enfermas con ganglios axilares negativos y encontraron que la acumulación de p53, determinada por métodos histoquímicos, es un significativo factor pronóstico adverso para el intervalo libre de enfermedad41.
Pharoah et al (1999) en un estudio de metaanálisis del valor pronóstico de la p53 mutada comprobaron que en tres series de casos con p53 positiva y ganglios axilares negativos el riesgo combinado es 1,7 (1,2-2,3) y en otras tres series con ganglios axilares positivos el riesgo combinado es 2,6 (1,7-3,9)42.
Un hallazgo interesante referente a la p53: algunos agentes antitumorales tales como las radiaciones ionizantes actúan induciendo la apoptosis en las células tumorales y las células con p53 mutada son totalmente resistentes a las radiaciones terapéuticas, es decir, no entran en apoptosis43.
Nishimura et al (1999) concluyen que en el cáncer de mama la apoptosis puede reflejar el comportamiento biológico, principalmente un mayor grado de agresividad biológica y de pronóstico desfavorable44.
El problema aún no resuelto es la posibilidad de emplear la p53 para predecir la respuesta a la quimioterapia y creemos que es un problema que requiere más trabajos de investigación. Colleoni et al (1999) en un trabajo, que incluye pocos casos y su significación es limitada, observaron respuesta terapéutica en 12 de 14 casos con p53 positiva y en 31 de 59 casos con p53 negativa45.
