Fundamento. Aunque el principal efecto de los fibratos es promover el catabolismo de las lipoproteínas ricas en triglicéridos, incrementando la actividad lipoproteinlipasa y reduciendo la expresión de la apolipoproteína CIII, también parecen inhibir la secreción hepática de VLDL. Sin embargo, se desconoce cuál es el mecanismo por el que los fibratos producen dicha inhibición.
Métodos. En el presente trabajo se determinó, en ratas normolipémicas, el efecto de la administración durante 3 días de gemfibrozilo (el 0,3% p/p en la dieta) sobre los niveles de ARNm y las actividades de enzimas como la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa, la CTP:fosfocolina citidilil transferasa (CT) y la fosfatidato fosfohidrolasa (PAP), que intervienen directamente en el control de la síntesis hepática de colesterol, fosfolípidos y triglicéridos, así como la actividad microsomal transfer protein (MTP), imprescindible para un correcto ensamblaje de las VLDL. Paralelamente, se cuantificaron las concentraciones de lípidos plasmáticos y hepáticos, así como la actividad de ß-oxidación peroxisómica y el ARNm específico para la acil-CoA oxidasa (ACO), marcadores de la activación del PPAR* por fibratos.
Resultados. El tratamiento con gemfibrozilo no modificó las concentraciones de colesterol plasmático o intrahepático, ni las concentraciones hepáticas de triglicéridos o fosfolípidos, mientras que redujo significativamente las concentraciones plasmáticas de triglicéridos y fosfolípidos en un 30 y un 23%, respectivamente. La administración de gemfibrozilo careció de efecto sobre las actividades MTP y CT; tampoco afectó las concentraciones relativas del ARNm específico de la CT. Por el contrario, se detectó una fuerte inducción de la HMG-CoA reductasa, tanto en su actividad (16,7 veces), como en sus concentraciones de ARNm (3,7 veces); también se observó inducción de la actividad PAP (1,7 veces). En estudios in vitro, no se apreció ninguna modificación en la actividad de estas enzimas atribuible a la presencia de gemfibrozilo. La proliferación peroxisómica hepática producida por gemfibrozilo se manifestó en una inducción de la actividad de ß-oxidación peroxisómica (64%) y de las concentraciones de ARNm para la ACO (117%).
Background. The main effect of fibrates is to promote the catabolism of triglyceride-rich lipoproteins, by increasing the activity of lipoprotein lipase and reducing the expression of apo CIII. However, they seem also to inhibit hepatic VLDL output by an unknown mechanism.
Methods. We studied in normolipidemic rats the effects of gemfibrozil administration (0.3% w/w of rat chow) during three days on: 1) mRNA levels and activities of enzymes such as 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) reductase, CTP:phosphocholine cytidylyltransferase (CT) and phosphatidate phosphohydrolase (PAP), involved in the control of the hepatic synthesis of cholesterol, phospholipids and triglycerides; 2) Microsomal transfer protein (MTP) activity, essential for the correct assembly of VLDL; 3) Hepatic and plasma lipid concentrations; and 4) Hepatic peroxisomal ß-oxidation activity and the levels of acyl-CoA oxidase (ACO) mRNA, as markers of PPAR* activation by fibrates.
Results. Plasma and liver cholesterol, and liver triglycerides and phospholipids were not modified by drug treatment. Gemfibrozil induced reductions of plasma triglyceride (30%) and phospholipid (23%) concentrations. Neither MTP activity, nor CT activity or mRNA concentrations were affected by gemfibrozil, while a strong induction of HMG-CoA reductase activity (16.7 fold) and HMG-CoA reductase mRNA (3.7 fold) was detected; PAP activity was also induced (1.7 fold). However, gemfibrozil was unable to inhibit these enzyme activities in vitro. The peroxisomal proliferation induced by gemfibrozil was demonstrated by increases in the activity of the peroxisomal ß-oxidation system (64%) and ACO mRNA (117%).
Conclusions. The changes in liver HMG-CoA reductase and PAP enzymes produced by gemfibrozil administration were not related to the observed reduction in plasma triglycerides. In summary, the results show that, in normotriglyceridemic rats treated for a short period, the hypotriglyceridemic effect of gemfibrozil results from the well known activation of VLDL catabolism, with no significant modification of enzyme activities involved in the hepatic production of VLDL.
Introducción
Los derivados del ácido fíbrico o fibratos se utilizan ampliamente en el tratamiento farmacológico de las dislipemias, especialmente aquellas que cursan con una elevación más o menos acusada de la trigliceridemia. Su utilización clínica produce una marcada reducción en la concentración de triglicéridos plasmáticos, que se acompaña de un incremento en el colesterol HDL. La modificación del colesterol LDL producida por los fibratos es variable, dependiendo del tipo de dislipemia presente al inicio del tratamiento1,2.
El mecanismo de acción de los fibratos es complejo. El incremento del cHDL se debe, básicamente, a que los fibratos estimulan la expresión de los genes que codifican las apolipoproteínas apo AI y apo AII, apolipoproteínas mayoritarias de las HDL3,4. Igualmente, los fibratos incrementan la expresión hepática de la lipoproteinlipasa5, mientras que inhiben la producción de apo CIII6. Ambos efectos conducen a una marcada estimulación del catabolismo de las proteínas ricas en triglicéridos, especialmente VLDL e IDL. En todos los casos, los fibratos se comportan como agonistas de un receptor nuclear, el PPAR * , cuyo elemento de respuesta o PPRE está presente en las zonas promotoras de todos los genes diana de la acción de estos fármacos7.
Aunque el principal efecto de los fibratos es promover el catabolismo de las lipoproteínas ricas en triglicéridos, también parecen inhibir la secreción hepática de VLDL8. Sin embargo, se desconoce cuál es el mecanismo por el que los fibratos producen dicha inhibición. La mayoría de autores coinciden en señalar que la secreción de VLDL no está regulada por la velocidad de producción de apo B, sino por la síntesis de novo de los lípidos integrantes de estas lipoproteínas, colesterol, triglicéridos y fosfolípidos9,10. Por ello, en el presente trabajo se ha determinado, en ratas normolipémicas, el efecto de la administración de gemfibrozilo, un fibrato ampliamente utilizado en el tratamiento de las hipertrigliceridemias11, sobre las concentraciones de ARNm y las actividades de enzimas como la 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa, la CTP:fosfocolina citidilil transferasa (CT) y la fosfatidato fosfohidrolasa (PAP), que intervienen directamente en el control de la síntesis hepática de colesterol, fosfolípidos y triglicéridos, respectivamente12-14, así como de la actividad microsomal transfer protein (MTP), imprescindible para un correcto ensamblaje de las VLDL15. Paralelamente, se han cuantificado las concentraciones de lípidos plasmáticos y hepáticos, así como la actividad de ß -oxidación peroxisómica y el ARNm específico para la acil-CoA oxidasa (ACO), marcadores de la activación del PPAR * por fibratos16.
Material y métodos
Animales de experimentación y tratamiento
Ratas Sprague-Dawley (Harlan, Francia) macho, de un peso medio de 207 ± 11 g, se distribuyeron aleatoriamente en dos subgrupos de tratamiento y se alimentaron, respectivamente, con 28 g/día de dieta estándar (Panlab) o bien el mismo tipo y cantidad de alimentos suplementados con gemfibrozilo al 0,3% p/p, procediendo a su sacrificio por decapitación entre las 9 y 10 h, al cabo de 3 días de tratamiento. Las dos dietas se prepararon tal como se ha descrito anteriormente17. Todos los animales utilizados en este estudio se sometieron previamente a un período de aclimatación de 5 días de duración, con dieta y agua ad libitum, en condiciones de humedad y temperatura constantes y con un ritmo circadiano de luz-oscuridad de 12 h de duración.
Obtención de las muestras
Una vez extraídos y perfundidos los hígados, éstos se homogeneizaron a 4 °C en tampón NaCl 150 mM, dithiotreitol 1 mM, EDTA 30 mM y KH2PO4 50 mM a pH 7,4; se obtuvieron las fracciones posmitocondrial, microsomal y citosólica por centrifugación18 y se congelaron a 80 °C hasta el momento de su uso. La concentración proteica de cada fracción se determinó por el método de Bradford19. Entre 10 y 100 mg de tejido se congelaron inmediatamente en N2 para la posterior extracción del ARNm total mediante el reactivo Ultraspect (Biotecx). Las muestras de sangre se recogieron en el momento del sacrificio en tubos heparinizados; una vez obtenido el plasma por centrifugación, éste se conservó a 80 °C.
Determinación de las actividades enzimáticas
Las actividades de las enzimas HMG-CoA reductasa (EC 1.1.1.34), CT (EC 2.7.7.15) y del sistema de ß -oxidación peroxisómica de ácidos grasos se valoraron según métodos previamente descritos20,21. Para la determinación de la actividad PAP (EC 3.1.3.4) se utilizó el método de Martin et al22, utilizando como sustrato una suspensión de ácido (14C)fosfatídico y fosfatidilcolina, preparada según el método descrito por Aridor-Piterman et al23. La actividad MTP se valoró mediante el kit WAK-MTP-100 (Wak-Chemie Medical Gmbh), tal como indican las instrucciones del fabricante.
Valoración de las concentraciones de lípidos
Los lípidos plasmáticos se valoraron mediante tests colorimétricos comerciales (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania). En concreto se utilizaron los test CHOL MPR-2 1442350 para el colesterol total y cHDL, F-CHOL MPR-1 310328 para el colesterol libre, GPO-PAP 701882 para los triglicéridos y MPR-2 691844 para los fosfolípidos. Para la valoración del cHDL, se eliminó previamente el colesterol asociado a la apo B por precipitación con el reactivo HDL C 543004 (Boehringer Mannheim). Los lípidos hepáticos se extrajeron por el método de Bligh & Dyer24 a partir del sobrenadante posnuclear hepático. Para cada muestra, 1,5 ml del extracto clorofórmico se evaporaron a sequedad bajo corriente de nitrógeno, se redisolvieron en etanol absoluto y se procedió a determinar la concentración de los lípidos hepáticos de forma idéntica a la descrita para los lípidos plasmáticos.
Reacción de la transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
La reacción de RT-PCR se realizó básicamente tal como se ha descrito25, utilizando los siguientes cebadores específicos: 5'-GGT TTA CGG CAG CCA GCT CCT- 3' y 5' -ACG GAC AAT GCG GGT GAT GAT -3' para el gen ct, 5' -CCG ACA AGA AAC CTG CTG CCA -3' y 5' -CAG TGC CAC ACA CAA TTC GGG -3' para el gen hmg-CoA reductasa y 5' -ACT ATA TTT GGC CAA TTT TGT -3' y 5'- TGT GGC AGT GGT TTC CAA GCC -3' para el gen aco. Como gen de referencia para la normalización de los resultados se utilizó el gen aprt (adenosil fosforibosil transferasa) (5'- AGC TTC CCG GAC TTC CCC ATC -3' y 5'- GAC CAC TTT CTG CCC CGG TTC -3'). Para marcar los fragmentos amplificados se utilizó * -[32P]-dATP. El producto de la reacción de PCR se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%, se reveló con una película RX X-OMAT S Kodak y se cuantificó la intensidad de las bandas, previa digitalización de las mismas, con el programa IMAT (Servicio Científico Técnico de la Universidad de Barcelona).
Tratamiento estadístico
Los resultados se expresan en forma de media ± DE. Las comparaciones entre medias se han realizado mediante el test de la t de Student para datos no apareados. Se prefijó un nivel de significación para p ¾ 0,05. En casos de variancias no homogéneas, los resultados se transformaron a escala logarítmica (p. ej., triglicéridos plasmáticos). Los análisis de correlación entre variables se realizaron mediante el test de correlación lineal de Pearson. En todos los casos se ha utilizado el programa informático Graphad-Instat®.
Resultados
El tratamiento con gemfibrozilo no modificó ni las concentraciones de colesterol, tanto plasmático como hepático, ni las concentraciones hepáticas de triglicéridos y fosfolípidos (tabla 1), mientras que redujo significativamente las concentraciones plasmáticas de triglicéridos y fosfolípidos (fig. 1) en un 30 y un 23%, respectivamente.
En cuanto a las enzimas estudiadas, ni la actividad MTP, ni la actividad CT, así como las concentraciones relativas de su ARNm específico, fueron afectadas por la administración de gemfibrozilo (tabla 2). Por el contrario, los animales tratados con el fármaco presentaron una fuerte inducción de la HMG-CoA reductasa, tanto en su actividad (16,7 veces) como en las concentraciones de ARNm (3,7 veces) (fig. 2). Este efecto del gemfibrozilo no estaba relacionado con una interacción directa del fármaco con la HMG-CoA reductasa, ya que en los estudios in vitro no se detectó ninguna modificación en la actividad de esta enzima atribuible a la presencia de gemfibrozilo (tabla 3). Igualmente, la actividad PAP se incrementó 1,7 veces en los animales tratados con gemfibrozilo (tabla 2), sin que el fármaco fuera capaz de modificar la actividad PAP in vitro (tabla 3).
Por último, la proliferación peroxisómica producida por gemfibrozilo se manifestó en una inducción de la actividad de ß -oxidación peroxisómica (64%) y de las concentraciones de ARNm para la ACO (117%) (fig. 3).
Discusión
En las condiciones de nuestro estudio, el único efecto del gemfibrozilo sobre los lípidos plasmáticos y hepáticos fue reducir las concentraciones plasmáticas de triglicéridos y fosfolípidos. Este comportamiento se produce típicamente tras la administración de gemfibrozilo a ratas y ratones26-28 y va asociado al fenómeno de proliferación peroxisómica28,29, caracterizado por la inducción del sistema de ß -oxidación peroxisómica de ácidos grasos y de la acil-CoA oxidasa, enzima limitante del sistema16. Tanto el estímulo del catabolismo de los triglicéridos asociados a las VLDL como la proliferación peroxisómica son fenómenos derivados de la activación del receptor PPAR * por el gemfibrozilo7.
La actividad MTP es imprescindible para un correcto ensamblaje de las lipoproteínas hepáticas30,31 y representa una diana farmacológica evidente para el control de la producción hepática de VLDL32. Hasta el momento no se conoce el efecto de los fármacos hipolipemiantes clásicos sobre la MTP. Según los resultados obtenidos en este estudio, el gemfibrozilo, un fármaco hipotrigliceremiante típico, no afecta la actividad MTP ni in vivo ni in vitro. Por otra parte, el hecho de que no se modifique la actividad MTP en presencia de una evidente inducción de la actividad de ß -oxidación peroxisómica producida por la administración del gemfibrozilo indica, aunque de forma indirecta, que la MTP no se encuentra regulada por el receptor PPAR * .
El efecto que producen los fibratos y otros proliferadores peroxisómicos sobre la actividad CTP: fosfocolina citidilil transferasa es controvertido, encontrándose tanto una reducción20,33, como un incremento34 en su actividad tras la administración de estos compuestos a animales de experimentación. En nuestro caso, el gemfibrozilo no modificó esta actividad enzimática, aunque fue capaz de provocar las manifestaciones típicas del fenómeno de proliferación peroxisómica. Estos resultados indicarían que la modificación de la actividad CTP:fosfocolina citidilil transferasa dependería, no de una propiedad genérica del fármaco (p. ej., proliferador peroxisómico), sino de las características propias de cada molécula, la especie animal y el tejido estudiado.
Aunque parezca un efecto paradójico, el incremento de la actividad HMG-CoA reductasa tras la administración de gemfibrozilo a ratas es un fenómeno que ha sido bien documentado28,35,36. Los resultados de este estudio permiten relacionar el incremento en actividad con un incremento en las concentraciones de ARNm específico para la enzima, lo que podría reflejar un posible incremento en la expresión del gen de la HMG-CoA reductasa tras la administración del gemfibrozilo. Hashimoto et al28 demostraron que el gemfibrozilo, a concentraciones fisiológicas, era capaz de inhibir la actividad HMG-CoA reductasa, con lo que el incremento en la actividad enzimática tras la administración del fármaco in vivo se podría explicar como un mecanismo de retroalimentación similar al que sucede tras la administración de estatinas37. Sin embargo, ni Krause et al36 ni nosotros mismos (tabla 3) hemos podido evidenciar in vitro una inhibición de la actividad reductasa, con lo que parece poco probable que se produzca un fenómeno de retroalimentación.
Desde principio de la década de los noventa se conoce que los peroxisomas son capaces de sintetizar colesterol, presentando actividad HMG-CoA reductasa38. Por tanto, la proliferación peroxisómica inducida por gemfibrozilo, así como el aumento en el retículo endoplasmático producido por este fármaco39, podrían explicar el incremento en la expresión y la actividad de la HMG-CoA reductasa. En este sentido, es de destacar que hemos detectado una elevada correlación (superior al 70%) entre la actividad HMG-CoA reductasa y la actividad de ß -oxidación peroxisómica (tabla 4), así como entre las concentraciones de ARNm para la reductasa y la acil-CoA oxidasa (tabla 4). La relación entre ambos fenómenos sería de tipo indirecto, dado que no se ha descrito hasta el momento la existencia de un PPRE en la zona promotora del gen de la HMG-CoA reductasa. En cualquier caso, la posible acumulación de colesterol hepático producido por el incremento de la actividad HMG-CoA reductasa se vería contrarrestado, al menos en parte, por el aumento de la excreción biliar de colesterol producido por el fármaco40.
Igualmente, en el presente estudio, el gemfibrozilo determinó un incremento notorio en la actividad PAP. Según nuestros resultados y los obtenidos en otros laboratorios41-43, este fenómeno no parece estar relacionado directamente con la proliferación peroxisómica. Dado que el gemfibrozilo no inhibe in vitro la actividad PAP, podría descartarse una inducción de esta actividad enzimática por retroalimentación. Por el contrario, se ha podido detectar una fuerte correlación (53%) entre la actividad PAP y la actividad HMG-CoA reductasa. Este comportamiento sería similar al producido por estatinas en ratas normolipémicas, en las que se aprecia un incremento de ambas actividades enzimáticas, acompañado de un potente efecto hipotrigliceridemiante37,44. Los fibratos no sólo incrementan la excreción biliar de colesterol, sino también la de fosfolípidos, induciendo la expresión hepática de la P-glicoproteína mdr245. Este fenómeno podría conciliar la situación, aparentemente contradictoria, en la que un fármaco hipolipemiante como el gemfibrozilo, administrado a ratas normolipémicas, es capaz de reducir de forma paralela las tasas plasmáticas de triglicéridos e incrementar la actividad PAP hepática. Igualmente, este efecto sobre la actividad PAP explicaría que, en cultivos de células no hepáticas, se detecte un incremento neto en la síntesis de triglicéridos tras la administración de gemfibrozilo46.
En conjunto, nuestros resultados indicarían que, en ratas normotrigliceridémicas y en un tratamiento de corta duración, el efecto hipotrigliceridemiante del gemfibrozilo parece deberse exclusivamente a la conocida activación del catabolismo de las VLDL5,6, sin que se afecten significativamente actividades enzimáticas que controlan la producción hepática de estas lipoproteínas.
Agradecimiento
Este trabajo ha sido realizado gracias a la financiación proporcionada por la FPCNL, CICYT (becas SAF97-0215 y SAF98-0105), Generalitat de Catalunya (becas SGR96-84 y 1998SGR-33), así como la beca de la Sociedad Española de Arteriosclerosis-Parke Davis 1996. N. Roglans es becaria de Docencia e Investigación de la Universidad de Barcelona