Objetivo. Evaluar el papel que desempeñan las diferentes especies reactivas de oxígeno sobre la función endotelial en conejos con dislipemia. Asimismo, evaluar si el efecto de la atorvastatina sobre la función endotelial puede ser consecuencia de una reducción en la disponibilidad de radicales libres de oxígeno.
Métodos. Se han utilizado conejos New Zealand alimentados con una dieta estándar o una dieta que contenía un 0,5% de colesterol más un 14% de aceite de coco, tratados o no con atorvastatina (2,5 mg/kg/día) durante 8 semanas. Se evaluó la respuesta a la acetilcolina (109-105 mol/l) en anillos de aorta precontraídos con fenilefrina, en presencia o ausencia de superóxido dismutasa (104 mol/l), catalasa (104 mol/l) y deferoxamida (104 mol/l) para valorar el efecto en la respuesta de los aniones superóxido, H2O2 y radicales hidroxilo, respectivamente, en dicha respuesta. Asimismo, se evaluó esta respuesta en presencia de un inhibidor de la xantina oxidasa (alopurinol, 104 mol/l), con objeto de valorar el papel de esa enzima en la producción de aniones superóxido.
Resultados. Los conejos alimentados con una dieta enriquecida con colesterol y aceite de coco presentan valores plasmáticos de colesterol y triglicéridos superiores a los de los conejos alimentados con una dieta estándar. Asimismo, tuvieron una menor respuesta relajante a la acetilcolina. La presencia en el medio de incubación de alopurinol, superóxido dismutasa y deferoxamida mejoró la vasorrelajación a la acetilcolina en los conejos dislipémicos, pero no la modificó en los conejos control. El pretratamiento de los anillos con catalasa no modificó dicha respuesta en ninguno de los dos grupos de dieta. El tratamiento con atorvastatina redujo los valores de colesterol y triglicéridos en los conejos dislipémicos y previno la reducción en la vasorrelajación a la acetilcolina, careciendo de efecto en los conejos control. La presencia en el medio de incubación de cualquiera de los pretratamientos (alopurinol, deferoxamida, superóxido dismutasa y catalasa) no modificó la vasorrelajación a la acetilcolina en los conejos tratados con atorvastatina.
Conclusiones. Estos datos sugieren que, en conejos dislipémicos, la menor vasorrelajación inducida por la acetilcolina es consecuencia, al menos parcialmente, de un aumento en la formación de aniones superóxido a través de la xantina oxidasa, así como de un aumento de la disponibilidad de radicales hidroxilo. Además, el tratamiento con atorvastati
Objective. To evaluate the role of different reactive oxygen species on the endothelial dysfunction associated with dyslipidemia in rabbits. In addition, to study whether the effect of atorvastatin on endothelial function is due to reduction of oxidative stress.
Methods. New Zealand rabbits were fed either a standard diet or a diet enriched with 0.5% cholesterol and 14% coconut oil, and were treated with atorvastatin (2.5 mg/kg/day) for 8 weeks or were left untreated. We studied dose-response curves to acetylcholine (109-105 mol/l) in phenylephrine-contracted aortic rings in the presence or absence of superoxide dismutase (104 mol/l), catalase (104 mol/l), and deferoxamine (104 mol/l) in order to assess the effect of superoxide anions, H2O2, and hydroxil radicals, respectively, on this response. Likewise, we evaluated the effect of a xanthine oxidase inhibitor (alopurinol, 104 mol/l) to examine the role of this enzyme on superoxide anion production.
Results. Rabbits fed a diet enriched with cholesterol and coconut oil showed higher plasma levels of cholesterol and triglycerides than control animals. Likewise, rings from dyslipidemic rabbits had a lower relaxation response to acetylcholine than control animals. The presence of alopurinol, superoxide dismutase, and deferoxamine increased the relaxation induced by acetylcholine in dyslipidemic rabbits, but did not modify it in control rabbits. Preincubation with catalase did not change the dose-response curves to acetylcholine in any diet group. Atorvastatin treatment reduced both cholesterol and triglyceride plasma levels only in dyslipidemic rabbits. Likewise, atorvastatin was able to prevent the reduction in the relaxation to acetylcholine. The presence of alopurinol, deferoxamine, superoxide dismutase, or catalase in the incubation media did not further modify the relaxation to acetylcholine in atorvastatin-treated rabbits.
Conclusions. The results suggest that the reduced relaxation response to acetylcholine in dyslipidemic rabbits is due, at least in part, of increased anion superoxide production by xanthine oxidase and the availability of hydroxyl radicals. Atorvastatin treatment prevents the endothelial dysfunction associated with dyslipidemia. The beneficial effect exerted by atorvastatin appears to be due in part to a decreased availability of reactive oxygen species.
Introducción
Las especies reactivas de oxígeno, como el anión superóxido, se producen normalmente en todos los tejidos por acción del metabolismo oxidativo mitocondrial1. Asimismo, una serie de enzimas como la NADH/NADPH oxidasa, la xantina oxidasa, el citocromo P450 o la ciclooxigenasa pueden aumentar su producción en la pared vascular2,3. El anión super óxido es degradado principalmente por la acción de la enzima superóxido dismutasa a peróxido de hidrógeno, que es degradado a su vez por la catalasa en presencia de ion ferroso al radical hidroxilo, que ejerce importantes efectos deletéreos sobre la función celular4,5. Además, el anión superóxido degrada el óxido nítrico (NO) a peroxinitritos, siendo esta reacción más rápida que con la superóxido dismutasa6. A diferencia del NO, los peroxinitritos no son vasodilatadores y producen daño celular7.
En la arteriosclerosis se ha demostrado repetidamente que existe un incremento de las especies reactivas de oxígeno. Este incremento parece ser consecuencia tanto de la estimulación de enzimas que intervienen en su formación como por la activación de células inflamatorias en la pared vascular8,9. Un aumento del estado oxidativo no sólo va a favorecer la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL)10, sino una mayor formación de peroxinitritos6, que pueden participar en la disfunción endotelial que se asocia a la arteriosclerosis. Ésta se caracteriza por una reducción en la vasodilatación dependiente de endotelio, lo que sugiere una disminución en la disponibilidad de NO11-13.
Las estatinas reducen la síntesis de colesterol al inhibir la enzima hidroximetilglutaril CoA (HMG CoA) reductasa, la enzima limitante en la síntesis del colesterol14. La inhibición de la HMG CoA reductasa no sólo reduce la síntesis de colesterol, sino también la síntesis de una serie de compuestos como los dicoles, las ubiquinonas y las proteínas isopreniladas, que intervienen en diferentes funciones celulares15. Los estudios clínicos han demostrado que las estatinas son efectivas en la reducción de episodios cardiovasculares, tanto en prevención primaria como secundaria16,17. Asimismo, la administración de estatinas se asocia a una mejoría de la disfunción endotelial18-21 y a una reducción de la lesión aterosclerótica20,22,23. Sin embargo, aún no está bien establecido si los efectos beneficiosos de las estatinas sobre la función endotelial pueden deberse, en parte, a una reducción del estrés oxidativo. Por tanto, el objetivo del presente trabajo fue evaluar el papel que desempeñan las diferentes especies reactivas de oxígeno sobre la función endotelial en conejos con dislipemia. Asimismo, se evalúa si el efecto de la atorvastatina sobre la función endotelial puede realizarse actuando sobre la disponibilidad de radicales libres de oxígeno.
Materiales y métodos
El estudio se realizó en 32 conejos de la cepa New Zealand (Granja Cunicular San Bernardo, Navarra) con un peso inicial de 1857 ± 30 g. Los animales fueron mantenidos bajo unas condiciones de luz y temperatura controladas, libre acceso al agua de bebida y alimentados con una dieta estándar o una dieta que contenía un 0,5% de colesterol más un 14% de aceite de coco (Mucedola s.r.l., Milán, Italia) durante 8 semanas. La mitad de los animales de cada grupo fueron tratados con atorvastatina (2,5 mg/kg/día), administrada en la comida durante el mismo período. Todos los experimentos fueron aprobados por el comité para el uso y el cuidado de animales de la Universidad Complutense, de acuerdo con las normas de la Unión Europea para el tratamiento ético de los animales de experimentación.
Análisis bioquímicos
Las muestras de sangre fueron recogidas en tubos que contenían ácido etilenediamina tetra acético (EDTA) a una concentración final de 10-7 mol/l mediante un catéter insertado en la arteria de la oreja de los conejos. Los valores plasmáticos de colesterol y triglicéridos se determinaron por reacción colorimétrica con un kit comercial (Boehringer-Mannheim).
Reactividad vascular
Después de recoger las muestras de sangre, los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico (25 mg/kg i.v.). Se extrajo la aorta torácica, eliminando el tejido superficial adherido y cortándola transversalmente en anillos arteriales de 3-4 mm de longitud. Los anillos aórticos se colocaron en baños de órganos con una solución de Krebs a 37 °C y oxigenada (95% de O2 y 5% de CO2) con un pH fisiológico (7,47,6), suspendidos entre dos alambres de acero en forma de "L". El alambre superior fue conectado a un transductor de fuerza (modelo FT03, Grass) y acoplado a un sistema computarizado (McLab modelo 8E, AD Instruments) para registrar los cambios desarrollados en la tensión isométrica. Los anillos se equilibraron durante un período de 60-90 min, durante el cual se cambió la solución cada 15 min, y se ajustó la tensión basal de los anillos a 2 g. En estudios previos, hemos observado en anillos de aorta de conejos controles que una tensión basal de 2 g es óptima para la contracción inducida por KCl. Cuando la tensión isométrica fue estable, se iniciaron los experimentos, obteniéndose una respuesta contráctil de referencia a KCl (80 mmol/l). Al final del experimento, la presencia o ausencia de un endotelio funcional se verificó en los anillos aórticos precontraídos con fenilefrina mediante la valoración de la presencia de una respuesta vasorrelajante a una dosis alta de acetilcolina (10-5 mol/l).
Con objeto de estudiar los posibles mecanismos implicados en los efectos de la dislipemia y/o el tratamiento con atorvastatina, se evaluó la respuesta a la acetilcolina (109105 mol/l) en anillos precontraídos con una dosis submáxima de fenilefrina (106 mol/l) y en presencia o ausencia de la superóxido dismutasa (SOD; 104 mol/l), catalasa (104 mol/l), y deferoxamida (104 mol/l), para estudiar el posible papel de los aniones superóxido, H2O2 y radicales hidroxilo, respectivamente. Asimismo, se evaluó dicha respuesta en presencia de un inhibidor de la xantina oxidasa (alopurinol, 104 mol/l), con objeto de valorar el papel de dicha enzima en la producción de aniones super óxido.
Reactivos y fármacos
La atorvastatina fue obtenida de Parke Davis. Los reactivos utilizados para los estudios de reactividad fueron comprados a Sigma Chemical Co. Las soluciones de los reactivos se prepararon en agua destilada y fueron diluidas a la concentración deseada en solución de Krebs inmediatamente antes del comienzo del experimento. Las concentraciones se expresan como la concentración molar final alcanzada en el baño.
Análisis estadístico
La respuesta relajante se expresó como el porcentaje de la reducción de la tensión en el anillo precontraído. Los resultados se expresan como la media ± EEM de los anillos de 8 conejos. Las curvas dosis-respuesta fueron comparadas mediante un análisis de la variancia múltiple para medidas repetidas con el programa estadístico (CSS, Statof Inc.). El resto de los datos fueron analizados mediante una análisis de la variancia de una sola vía (ANOVA), seguido de un test Newman-Keuls si se observaban diferencias. La hipótesis nula fue rechazada cuando el valor de la probabilidad fue inferior a 0,05.
Resultados
Los conejos alimentados con una dieta enriquecida con colesterol y aceite de coco durante 8 semanas presentaron unos valores plasmáticos de colesterol y de triglicéridos significativamente superiores que los de los conejos alimentados con una dieta control (tabla 1). El tratamiento concomitante con atorvastatina atenuó significativamente dicho incremento, aunque no fue capaz de normalizarlo (tabla 1). Al final del experimento no hubo diferencias significativas en el peso corporal entre ningún grupo (datos no expuestos).
Como se observa en la figura 1, la respuesta relajante a la acetilcolina está reducida (p < 0,05) en los anillos aórticos de conejos alimentados con una dieta con alto contenido en colesterol en comparación con los anillos de conejos control. La presencia de superóxido dismutasa mejora ligeramente la vasorrelajación a la acetilcolina en los conejos dislipémicos, pero no la modifica en los conejos control (fig. 2, panel izquierdo). Asimismo, la presencia de alopurinol (fig. 3, panel izquierdo) y deferoxamida (fig. 4, panel izquierdo) aumenta la respuesta a la acetilcolina sólo en conejos dislipémicos, aunque este efecto es más evidente en presencia de alopurinol. Por el contrario, la presencia de catalasa en el medio de incubación no modifica la respuesta a la acetilcolina ni en los anillos de conejos controles ni en los de los conejos dislipémicos (fig. 5, panel izquierdo).
La administración de atorvastatina previene la reducción en la respuesta a la acetilcolina en conejos dislipémicos, aunque no modifica la respuesta en los anillos de los conejos control (fig. 1). Tampoco la presencia de superóxido dismutasa, alopurinol, deferoxamida o catalasa en el medio de incubación mejoran más la respuesta a la acetilcolina en los anillos de los conejos dislipémicos tratados con atorvastatina (figs. 2-5, panel derecho).
Discusión
El presente trabajo pone de manifiesto que la menor respuesta a la acetilcolina observada en conejos dislipémicos parece ser consecuencia, en parte, de una mayor disponibilidad de especies reactivas de oxígeno, como los radicales hidroxilo y aniones superóxido producidos, estos últimos, por la acción de la xantina oxidasa. Asimismo, el tratamiento crónico con atorvastatina previene la reducción en la respuesta a la acetilcolina producida por la ingestión de una dieta con alto contenido en colesterol y aceite de coco. Este efecto beneficioso ejercido por la atorvastatina parece ser debido, al menos parcialmente, a la reducción de la disponibilidad de radicales libres.
De acuerdo con estudios clínicos y experimentales, el presente trabajo evidencia que la hipercolesterolemia está asociada con una respuesta vascular alterada a agentes vasodilatadores dependientes de endotelio como la acetilcolina11-13. Se han implicado diversos mecanismos en esta reducción en la respuesta a la acetilcolina incluida una menor disponibilidad de NO. Esta reducción en los valores de NO podría ser consecuencia, al menos, de: a) una menor expresión de la enzima que mediatiza su síntesis (NO sintasa endotelial) debida a las LDL oxidadas24,25; b) una reducción en los valores del cofactor tetrahidrobiopterina, necesario para la formación de NO26; c) una alteración en el mecanismo de transducción27; d) un aumento en los valores de dimetil arginina asimétrica (ADA), un inhibidor endógeno de la síntesis de NO28, y e) una mayor degradación de NO por un aumento de las especies reactivas de oxígeno27. En este sentido, el presente trabajo sugiere que la menor respuesta a la acetilcolina puede ser, en parte, consecuencia de una mayor producción de aniones superóxido a través de la xantina oxidasa, ya que la presencia de alopurinol, el inhibidor de esta enzima, aumenta la respuesta a la acetilcolina. De hecho, en estudios previos se ha implicado a la xantina oxidasa en la producción de aniones superóxido en conejos hipercolesterolémicos29. Asimismo, Cardillo et al han observado que la administración de alopurinol mejora la vasodilatación mediada por NO en pacientes hipercolesterolémicos30.
El papel de los aniones superóxido en la disfunción endotelial observada en los conejos dislipémicos se apoya también en la observación de que la presencia de la superóxido dismutasa mejora la vasorrelajación a la acetilcolina. Resultados similares se han obtenido previamente por otros autores31,32. No existe una explicación clara al hecho de que el aumento en la vasorrelajación a la acetilcolina sea menor que la observada en presencia de alopurinol, aunque podría ser consecuencia de que las condiciones experimentales no fueron las óptimas para que la superóxido dismutasa alcanzase su máxima capacidad de eliminar aniones superóxido. Sin embargo, es importante mencionar que, en experimentos previos, hemos observado que la superóxido dismutasa, a la dosis utilizada, aumenta la vasorrelajación inducida por la acetilcolina en ratas espontáneamente hipertensas (datos no publicados).
En el presente trabajo también se muestra que los radicales hidroxilo, aunque no el peróxido de hidrógeno, contribuyen a la alteración de la reactividad vascular observada en los conejos dislipémicos. En este sentido, Galle et al32 han observado que la catalasa no potencia más el efecto beneficioso sobre la vasorrelajación a la acetilcolina inducido por la superóxido dismutasa en la aorta de conejos. Asimismo, numerosos estudios han indicado el efecto deletéreo que ejercen los radicales hidroxilo sobre la función vascular en hipercolesterolemia33-35.
Las especies reactivas de oxígeno formadas a partir de la molécula de oxígeno son metabolitos altamente reactivos, que reaccionan con todo tipo de moléculas biológicas, incluyendo proteínas, lípidos, hidratos de carbono y NO, entre otras6,10. Esta última reacción da lugar a peroxinitritos que, a diferencia de su precursor, no son vasodilatadores y producen daño celular7. Por tanto, un aumento de radicales libres y la consiguiente reducción de los valores de NO podría participar en la disfunción endotelial observada en los conejos dislipémicos. El NO no sólo es un potente vasodilatador, sino que también ejerce importantes acciones antiateroscleróticas, ya que inhibe la proliferación celular, la agregación plaquetaria y la expresión de moléculas de adhesión celular36; por tanto, es posible sugerir que una reducción de los valores de NO como consecuencia de un aumento de las especies reactivas de oxígeno podría participar en el desarrollo de la lesión aterosclerótica. De hecho, diversos estudios han indicado que los radicales libres son mitogénicos per se, estimulando la agregación plaquetaria y la expresión de factores de transcripción37-39. Del mismo modo, el estrés oxidativo se ha asociado a la muerte celular, pudiendo contribuir de esta manera a la inestabilidad de la placa de ateroma40. Por ello, teniendo en cuenta todo esto, se puede argumentar que los radicales libres participan en todo el proceso aterosclerótico, desde su origen hasta su complicación final, la rotura de la placa.
Como era de esperar, la administración de atorvastatina, un inhibidor de la HMGCoA reductasa, redujo de manera importante los valores de colesterol (38%) plasmático en los animales dislipémicos, aunque no fue capaz de normalizarlos, probablemente como consecuencia de los elevados valores alcanzados (34 veces los del grupo control). Este efecto puede ser debido tanto a su capacidad de reducir la síntesis de colesterol como de incrementar la expresión de los receptores de LDL14. Además, la atorvastatina previno el incremento de los niveles plasmáticos de triglicéridos como consecuencia, quizás, de la capacidad que tienen las estatinas de modular la expresión de proteínas implicadas en el metabolismo de los triglicéridos41.
El tratamiento con atorvastatina también previene la disfunción endotelial observada en los conejos dislipémicos, ya que los anillos de estos conejos presentan una respuesta a la acetilcolina casi similar a la observada en los anillos de conejos control. Estos resultados coinciden con los observados previamente, que demuestran que los fármacos que reducen los valores de colesterol mejoran la va sorrelajación dependiente de endotelio, tanto en pacientes como en modelos animales con hipercolesterolemia18-21. Diversos mecanismos pueden participar en este efecto beneficioso ejercido por la atorvastatina sobre la función endotelial: a) un aumento en la síntesis de NO, ya que las estatinas estimulan la expresión de la NO sintasa endotelial y también impiden su inhibición inducida por las LDL oxidadas24,25; b) una disminución de la disponibilidad de factores vasoconstrictores, ya que se ha sugerido que estos fármacos pueden reducir la disponibilidad de tromboxano A2 y endotelina21,24, y c) la reducción de la lesión aterosclerótica que está asociada al tratamiento con estatinas20,22,23. Además, este trabajo también sugiere que la mejora en la disfunción endotelial observada en los animales dislipémicos tratados con atorvastatina puede ser debida a una reducción en el estrés oxidativo y la consecuente reducción en la degradación de NO. Esta afirmación se basa en el hecho de que ni la presencia de alopurinol, de superóxido dismutasa ni de deferoxamida modifican la vasorrelajación a la acetilcolina en conejos dislipémicos tratados con atorvastatina. En este sentido, en un trabajo previo, se ha observado que la simvastatina in vitro reduce la formación de aniones superóxido42, lo que podría explicar el hecho de que el tratamiento con estatinas reduce la susceptibilidad de las LDL a la oxidación en pacientes hipercolesterolémicos43. No existen en la actualidad datos en la bibliografía que indiquen el mecanismo a través del cual las estatinas reducen la formación de radicales libres, aunque podría implicar una disminución en los valores de proteínas implicadas en el transporte mitocondrial de electrones, las ubiquinonas, cuya síntesis disminuye como consecuencia de la profunda inhibición de la vía del ácido mevalónico inducida por la estatinas15.
En resumen, todos estos datos indican que, en conejos, valores plasmáticos elevados de colesterol y triglicéridos se asocian a una reducción en la vasorrelajación a la acetilcolina. Esta disfunción endotelial parece ser consecuencia, al menos en parte, de un aumento en la formación de aniones superóxido a través de la xantina oxidasa, así como a un aumento de la disponibilidad de radicales hidroxilo. Asimismo, el tratamiento con atorvastatina previene la disfunción endotelial asociada a la dislipemia. Este efecto beneficioso parece ser, al menos en parte, consecuencia de su capacidad de reducir la formación de especies reactivas de oxígeno.
Agradecimiento
Este trabajo ha sido posible gracias a la financiación recibida por parte de la Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología (SAF 98-0077), Fondo de Investigaciones Sanitarias de la Seguridad Social (98/003-02) y una ayuda de los Laboratorios Parke Davis. También agradecemos la asistencia técnica de Blanca Martínez y Antonio Carmona.