INTRODUCCION
Las aspartil-proteasas tienen una larga historia, ya que, probablemente, representan el primer tipo de enzimas conocidas en la humanidad. Así, en pinturas excavadas en el Sahara libio del período 5500-2000 a.C. se puede intuir la utilización de este tipo de enzimas de origen microbiano, precisamente, en el procesamiento de productos lácteos. Pero ha sido gracias al desarrollo definitivo de la bioquímica moderna, lo que ha permitido el despliegue del conocimiento acerca de las aspartil-proteasas. Durante la década de los 80 se produjo un incremento espectacular sobre el conocimiento de sus propiedades físico-químicas y biológicas. Esas características principales incluyen la tenencia de dos residuos de ácido aspártico en su molécula, su susceptibilidad a ser inhibidas por peptatinas (peptapéptidos producidos por varias especies de actinomyces) y su activación a un pH ácido. Entre las aspartil-proteasas humanas conocidas en la actualidad, se encuentran las pepsinas, gastrina, catepsina D, catepsina E, y renina (tabla 1). Estas enzimas se encuentran distribuidas ampliamente por el organismo humano, donde desempeñan funciones fisiológicas tan variadas como la digestión de proteínas en el estómago1, licuefacción del semen en la vagina2, catabolismo proteico en los lisosomas y remodelación tisular3. Además, las aspartil-proteasas también han sido implicadas en procesos patológicos humanos tales como úlceras gastro-duodenales4, infertilidad2, anemia perniciosa5, enfermedades del tejido conectivo6 y degenerativas del sistema nervioso central7.
Las aspartil-proteasas, especialmente la catepsina D, más recientemente el pepsinógeno C, han despertado un considerable interés en patología mamaria, especialmente en el cáncer. Así durante la década de los 90, se multiplicaron los esfuerzos de diferentes grupos sobre el papel que desempeñan estas enzimas en el diagnóstico, regulación hormonal, y, especialmente, pronóstico del cáncer de mama. Además, recientemente se ha descrito que la proteína del fluido quístico de 15 kDa de la enfermedad de los grandes quistes de la mama (GCDFP-15), o también denominada proteína inducible por la prolactina (PIP) es una nueva aspartil-proteasa.
CATEPSINA D
La catepsina D (cat D) está normalmente localizada en los lisosomas de todas las células a concentraciones bajas. Su función está relacionada con el catabolismo proteico a pH ácido, y sinérgicamente con otras catepsinas8. Además de esa acción proteolítica general en los lisosomas, la cat D también puede tener un papel crucial en la activación de proteínas en el compartimento perilisosomal. Así, se ha propuesto que la enzima podría desempeñar un papel en el procesamiento de antígenos9, en la proliferación celular y renovación tisular10, así como en la activación de diferentes prohormonas11,12. La importancia fisiológica de la cat D está demostrada en ratones "knock-out" de ese gen, en los que se observa que la pérdida de producción de la enzima induce necrosis y hemorragia en el intestino delgado, así como también apoptosis en las células linfoides10.
En la glándula mamaria normal, se ha sugerido que la cat D puede estar involucrada en el catabolismo proteico que acontece en la involución de las estructuras ductales y alveolares tras el cese de la lactancia y la involución uterina tras el parto13. El interés de esta enzima en el cáncer de mama se situó, en un principio, como un marcador de dependencia estrogénica, ya que representa una de las pocas proteínas cuya expresión está regulada por estrógenos en líneas celulares de cáncer mamario14. Aunque la razón de éste último aspecto permanece todavía oscura, sí al menos es evidente que la cat D es expresada en exceso en muchos carcinomas de mama, con unas concentraciones de 2 a 50 veces mayores en comparación a sus concentraciones en otras células tales como fibroblastos de las glándulas mamarias normales15, y que la enzima puede promover la proliferación celular actuando como un mitógeno16,17. Además existen datos experimentales que sugieren un papel de la enzima en la progresión tumoral. Así, se ha demostrado que la transfección de clones de células de cáncer mamario productoras de cat D en ratones ocasiona metástasis hepáticas de mayor tamaño que en aquéllos con clones de células no productoras de la enzima18,19.
Todos esos hallazgos han motivado una larga serie de estudios encaminados a investigar la posible significación biológica y clínica de la cat D en el cáncer de mama. Esos estudios evaluaron el contenido de la enzima en los tumores mamarios por métodos diferentes, como análisis inmunorradiométricos, análisis de "Western blot", inmunohistoquímicos, o medición directa de la actividad enzimática de la catepsina. Sin embargo, en función de esos diferentes métodos empleados en la determinación del contenido tumoral de la enzima, se desprenden resultados discordantes en cuanto a su significación pronóstica en el cáncer de mama. Así, mientras los estudios que evaluaron directamente las concentraciones de la cat D en los citosoles de los carcinomas mamarios describen una asociación significativa entre los niveles elevados de la enzima y una menor supervivencia total de las pacientes20-29, la mayoría de los estudios realizados mediante la técnica inmunohistoquímica, o bien no encontraron relación entre la expresión de la enzima por las células tumorales y el pronóstico de la enfermedad30-32 o, por el contrario, detectaron un valor pronóstico favorable de los valores intratumorales elevados de cat D en determinados subgrupos de pacientes33,34. Además, estudios similares también sugieren que la expresión de la cat D por las células estromales, como fibroblastos y macrófagos, más que por las células cancerosas mismas, pueden estar relacionadas de forma más decisiva con un pronóstico adverso de la enfermedad35-40. Sin embargo, también cabe señalar que existen trabajos que muestran resultados discordantes con todas esas posibilidades pronósticas de la cat D anteriormente señaladas41-44.
El cúmulo de toda esa información conflictiva en la literatura acerca de la significación biológica y clínica de la cat D en el cáncer de mama, ha motivado que la implicación de la cat D en este tipo de neoplasia haya sido considerada como la pieza de un gran "puzzle"45. Sin embargo, hay que considerar diferentes aspectos de la cat D en el cáncer de mama para comprender el complejo papel que parece desempeñar en el contexto de la fisiopatología tumoral de la neoplasia. Esos diferentes aspectos incluyen los relacionados con los métodos empleados en su determinación, localización morfológica de su expresión, mecanismo de su acción proteolítica, y otras acciones de la enzima relacionadas con la progresión tumoral.
En primer lugar, en relación con el método de determinación de la Cat D, existen claras ventajas y desventajas de cada uno de los diferentes métodos más habitualmente empleados. La determinación directa de la enzima en citosol de tumores mamarios mediante técnica de enzimoanálisis, aporta la clara ventaja de la objetividad y reproductividad del método, pero también presenta la limitación de que la determinación del contenido total de la proteasa no discrimina el origen celular de la misma. Por el contrario, las determinaciones mediante técnica inmunohistoquímica ofrecen la ventaja de una evaluación morfológica de la expresión tumoral de la enzima. Sin embargo, ésta última técnica puede adolecer de un falta de objetividad en la interpretación semicuantitativa de los valores de tinción inmunohistoquímica, lo que dificulta una correcta reproductibilidad de la cuantificación proteica. Además, a ello podemos añadir el inconveniente de aspectos técnicos tales como el procesamiento de tejidos mediante fijación, o bien la diferente especificidad de los distintos anticuerpos empleados en las determinaciones.
Pero, independientemente de las diferentes peculiaridades de los métodos empleados en la determinación de la cat D y el origen celular de su producción, debemos considerar cuáles son los mecanismos por los que, finalmente, la enzima está implicada en la progresión tumoral. El interés principal de las enzimas proteolíticas en patología tumoral está motivado por su papel potencial en la degradación de la membrana basal y matriz extracelular, facilitando así la invasión tumoral y las metástasis, que representan aspectos absolutamente claves en la historia natural del cáncer46. Si bien se ha demostrado que la cat D puede tener acción degradativa sobre distintos componentes de la matriz extracelular47,18, también es sabido que para poder ejercer esa acción proteolítica la enzima ha de ser capaz de actuar a un pH ácido, habitual en el compartimento intracelular, pero impropio del medio extracelular humano. Sin embargo, se han propuesto varias hipótesis para explicar esta asociación. Así se ha señalado que un pH ácido de 5,5, suficiente para la activación proteolítica de la cat D, puede ser alcanzado en algunas circunstancias en el compartimento extracelular de los tumores. Ello puede ser posible debido a la liberación al medio extracelular de protones, a través de la producción de ácido láctico y una bomba H+/Na+ATPasa funcionante en la membrana plasmática, por parte tanto de las células cancerosas como de los macrófagos peritumorales48. Además, considerando que las células tumorales pueden fagocitar material extracelular49,50, también se ha sugerido que la cat D desempeñaría un papel crucial en la digestión de ese material "engullido"51. De esa forma, la cat D no sólo contribuiría a la capacidad invasiva de los tumores, sino que la enzima también facilitaría la producción de nutrientes, tales como aminoácidos de la matriz extracelular, en las células tumorales durante su "emigración" a lugares distantes48.
Por otra parte, existen también otros mecanismos por los que la cat D parece estar implicada en la progresión tumoral. Así, se ha descrito que la sobreexpresión de cat D por las células tumorales incrementa la densidad celular mediante la inactivación de inhibidores del crecimiento liberados por las células confluyentes18,19, y, a la vez, facilita la liberación de factores de crecimiento desde la matriz extracelular. En relación con esta última posibilidad, se ha demostrado que la cat D, al degradar la matriz extracelular, ocasiona una liberación de factores de crecimiento y citoquinas que, como el factor transformante b y el factor de crecimiento fibroblástico, están normalmente atrapados en esa estructura en una forma inactiva48,52.
Así pues, todas esas evidencias experimentales de la cat D en la progresión tumoral contrastan con los resultados conflictivos derivados de la investigación clínica. Sin embargo, cabe destacar los resultados recientemente publicados por Foekens et al26, ya que esos autores realizaron un estudio sobre 2.810 extractos de citosoles mamarios correspondientes a los tumores de mujeres que fueron sometidas a un período medio de seguimiento clínico de 88 meses. Los resultados de ese estudio realizado sobre un considerable número de mujeres, y con un tiempo adecuado de seguimiento clínico, demostraron que las concentraciones citosólicas de la enzima predicen una temprana recurrencia tumoral y una supervivencia más corta de las pacientes. Esa asociación ocurrió en la totalidad de los subgrupos de pacientes, incluidas aquéllas con ganglios negativos o positivos, y premenopáusicas o posmenopáusicas. Además, el análisis multivariante realizado en ese estudio demostró que el valor predictivo de la cat D fue independiente de otros factores pronósticos considerados. Esos resultados, sin duda, pueden tener un gran interés clínico, principalmente de cara al manejo de pacientes con ganglios negativos, en las que existe todavía la necesidad de identificar nuevos factores pronósticos en base a los que seleccionar pacientes que podrían beneficiarse de terapias sistémicas. Sin embargo, a pesar de esos resultados aparentemente convincentes de Foekens et al26, existen aún algunos interrogantes sobre la cat D en patología tumoral, como que una proteasa intracelular pueda facilitar la invasión y metástasis, ya que no existe método en la actualidad que permita cuantificar específicamente la catepsina extracelular; o la cuestión aún no definitivamente aclarada de que la cat D pueda desempeñar su acción degradativa a un pH óptimo en el medio extracelular. Así pues, esa falta aún de razones biológicas plenamente demostradas sobre la asociación entre la expresión tumoral de la cat D y un comportamiento biológico agresivo del cáncer de mama limitan, en cierto modo, la toma de decisiones terapéuticas simplemente en base a los valores intratumorales de la enzima. Pero si, por el contrario, se demuestra que la cat D es parcial o totalmente responsable del comportamiento agresivo de los tumores, entonces urgiría el desarrollo de terapias encaminadas a inhibir específicamente la actividad de la enzima.
Finalmente, otro aspecto de interés potencial de la cat D es el del posible valor de su cuantificación en las secreciones mamarias. Así, por una parte, se han descrito concentraciones variables de la enzima en el fluido quístico de las pacientes con enfermedad macroquística de la mama53,54, siendo esos niveles intraquísticos de la enzima significativamente más elevados en los quistes tipo I (elevada relación intraquística K+/Na+, y epitelio de recubrimiento tipo apocrino) en relación con los quistes tipo II (baja relación K+/Na+, y epitelio plano)53. Así pues, considerando que los quistes tipo I han sido asociados por diferentes grupos con un riesgo aumentado de desarrollar carcinoma mamario55,56,57, podemos especular que la cat D podría desempeñar una acción mitogénica en ese epitelio mamario de "riesgo". En esa misma línea, cabe señalar también que se han descrito concentraciones significativamente más elevadas de cat D en las secreciones mamarias obtenidas a través del pezón de mujeres con cáncer de mama en relación con las obtenidas de mujeres controles o con patología mamaria benigna58. Por tanto, esos resultados apuntan a un posible valor potencial de la determinación de la enzima en las secreciones mamarias como marcador biológico de transformación maligna.
PEPSINOGENO C
A diferencia de la proteasa lisosomal catepsina D, que se expresa en todos los tipos celulares, el pepsinógeno C (pep C) es una enzima proteolítica de expresión muy restringida en los tejidos humanos. Su expresión en tejidos normales se encuentra limitada a la mucosa gástrica, donde está involucrada en el digestión de proteínas en el estómago, glándulas de Brünner del duodeno, próstata y vesículas seminales, algunos conductos pancreáticos secretores, y en los islotes de Langerhans del páncreas. Además, recientemente también se ha descrito su expresión en las fibras nerviosas y en las células epiteliales de las glándulas sudoríparas59. La relación entre pep C y patología mamaria surge tras el hallazgo de cantidades apreciables de la enzima en el fluido de los quistes mamarios60. Ese hecho podría aparentemente enmarcarse en la hipótesis que se ha denominado "mama-intestino"61, basada principalmente en la presencia de ácidos biliares en el fluido quístico62,63, y que postula que esas proteínas de origen digestivo podrían modular el microambiente del tejido mamario. Sin embargo, se ha demostrado que los ácidos biliares se acumulan en el fluido quístico, a través de un gradiente, procedentes del plasma61 y, por el contrario, el epitelio de los quistes mamarios presenta la capacidad de sintetizar y secretar cantidades significativas de pep C60.
Sin embargo, el interés principal del pep C en patología mamaria surge de la observación de que también un porcentaje significativo (en torno a un 40 %) de carcinomas mamarios muestra la capacidad de producir la enzima60. También se ha demostrado que esa expresión tumoral de la enzima está localizada en el citoplasma de las células cancerosas, y que los valores de la enzima son significativamente más elevados en los tumores bien diferenciados que en los pobremente diferenciados, así como también en los tumores con receptores de estrógenos positivos en comparación con aquellos negativos para ese parámetro biológico65. De acuerdo con esas observaciones, que sugieren una relación del pep C con lesiones de evolución favorable, en un estudio posterior realizado sobre 243 mujeres con cáncer de mama, se ha descrito que el pep C representa un nuevo factor favorable e independiente para predecir la recurrencia tumoral y la supervivencia total de las pacientes66. En este mismo sentido, muy recientemente Scorilas et al también detectaron una relación significativa de las concentraciones citosólicas intratumorales de pep C con un pronóstico favorable en pacientes con cáncer de mama67.
Así pues, esos datos, indicando la asociación de la expresión de pep C con lesiones tumorales de evolución favorable están, de algún modo, en contraposición con los estudios anteriormente señalados que implican a otra aspartil-proteasa, como es la cat D, con un pronóstico desfavorable en el cáncer de mama. Ello resulta, sin duda, indicativo del complejo papel que parecen desempeñar estas enzimas proteolíticas en el cáncer de mama. Una consideración que podría explicar el hecho de que el pep C no está asociado a lesiones de pronóstico desfavorable, procede de la observación de que esta enzima es secretado como un precursora de alto peso molecular que requiere un pH ácido para desempeñar su activación proteolítica60. Esas condiciones ácidas existen en la luz gástrica o en la vagina, donde es sabido que el pep C ejerce su acción proteolítica para la digestión de proteínas y en la licuefacción del semen, respectivamente. Sin embargo, como ya hemos señalado, es difícil que esas condiciones ácidas se puedan alcanzar en el medio extracelular mamario. Por el contrario, otra posibilidad por la que el pep C puede estar involucrado en la fisiopatología tumoral puede ser a través de su participación en una vía específica de señalización hormonal. De hecho, resultan ya suficientemente llamativos datos recientes que demuestran la expresión tumoral de la enzima también por carcinomas humanos con importante implicación hormonal, como los de origen ovárico, endometrial, prostático o melanomas59,68-70. Además, a ello podemos añadir la existencia de un cierto paralelismo del pep C con el antígeno prostático específico (PSA), puesto que también es una enzima regulada por andrógenos71, también se ha descrito en el fluido de los quistes mamarios72, y está presente en un porcentaje significativo de carcinomas mamarios, donde está asociada a un pronóstico favorable73. Más recientemente, Balbín y López-Otín mostraron la gran similitud entre la secuencia de nucleótidos que media la repuesta hormonal del gen del pep C en las células del cáncer de mama, con la correspondiente al gen del PSA74. Pero resultan aún más demostrativos los datos de esos mismos autores indicando también que los andrógenos, la progesterona y los glucocorticoides estimulan la expresión del pep C en líneas celulares de cáncer mamario, mientras que los estrógenos, los antiestrógenos y ciertos derivados del ácido retinoico no la modifican. Además, en probable relación con estos resultados experimentales, más recientemente se ha descrito que los carcinomas de mama del varón muestran niveles de pep C más elevados que los del sexo femenino75, lo que también puede resultar indicativo de diferencias en la biología molecular de esos tumores en función del sexo de los pacientes y, posiblemente, relacionadas con un diferente ambiente hormonal.
En definitiva, todos esos datos sugieren que el análisis de la expresión tumoral del pep C en al cáncer de mama no sólo nos proviene información pronóstica útil, sino que puede resultar indicativa de tumores que muestran una vía específica de respuesta hormonal. Por tanto, futuras investigaciones sobre la expresión del pep C en el cáncer de mama, pueden abrir la posibilidad de seleccionar pacientes de cara a nuevas alternativas terapéuticas de manipulación hormonal diferentes a la ampliamente utilizada de tipo antiestrogénico.
GCDFP-15
La GCDFP-15, también denominada proteína inducible por prolactina (PIP)76, gp1777, proteína secretada ligadora de actina78, o glicoproteína extraparotídea79, es una proteína secretada por varios tipos de glándulas exocrinas, tales como vesícula seminal, glándula salival y glándula sudorípara. El interés de esta proteína en patología mamaria surge tras el hallazgo de que, junto a la Zn-alfa2-glicoproteína, la apolipoproteína D y la albúmina, es una de las proteínas mayoritarias del fluido quístico de la enfermedad macroquística de la mama80-82. Posteriormente, se demostró que todas esas proteínas integran también el patrón proteico mayoritario de las secreciones mamarias obtenidas a través del pezón en aproximadamente el 90 % de las mujeres no lactantes y en el 50 % de las afectas de cáncer mamario83,84. Recientemente, se ha demostrado que la GCDFP-15 presenta características bioquímicas que permiten clasificarla como una nueva aspartil-proteinasa, y que su sustrato específico es la fibronectina85. El interés de la GCDFP-15 en el cáncer de mama se basa en diferentes aspectos que han sido investigados de esta proteína, como su valor como marcador de cáncer de origen mamario en metástasis de origen desconocido, como marcador de diferenciación apocrina, como posible marcador de respuesta hormonal, y como posible factor pronóstico.
Estudios realizados mediante técnica inmunohistoquímica revelan que la GCDFP-15 es la proteína más comúnmente expresada por los carcinomas mamarios86-93. Así, por ejemplo, Mazoujian et al87 detectaron un 53 % de estos tumores positivos para la proteína, y Wick et al93 un 70 %. Asimismo, se ha señalado que el mRNA de esta proteína es también detectado en la mayoría de los carcinomas mamarios y en las metástasis ganglionares axilares94. Por tanto, en base a la elevada especificidad que muestran los carcinomas mamarios para expresar la GCDFP-15, se ha propuesto su utilidad como marcador en la detección de lesiones metastásicas de origen mamario, ya que las metástasis de otros tumores que también pueden expresarla, como los carcinomas de glándulas salivales, de glándulas sudoríparas y próstata, son infrecuentemente confundidas con las de origen mamario95-99.
Por otra parte, la expresión de la GCDFP-15 ha sido propuesta como un índice muy válido de diferenciación apocrina de las células de cáncer mamario86,87,100-104. Este aspecto tiene una especial relevancia si consideramos que la morfología apocrina define un subgrupo de carcinomas mamarios que parecen responder preferentemente a un estímulo hormonal específico. En relación con este aspecto, estudios experimentales demostraron que la producción de GCDFP-15 es inducida por andrógenos en células de cáncer de mama105,106, a través de la mediación de los receptores de andrógenos107,108, mientras que los antiandrógenos la inhiben108. También se ha descrito una co-expresión de la GCDFP-15 con el antígeno prostático específico y con la positividad para los receptores de andrógenos, pero no para los receptores de estrógenos y progesterona, en los carcinomas mamarios primarios109. Así pues, esas observaciones pueden explicar el hallazgo de Bundred et al104 que detectaron un fallo de respuesta al tratamiento hormonal antiestrogénico en las pacientes con tumores que presentan una secreción elevada de GCDFP-15; mientras que aquellas pacientes que respondieron a esa manipulación hormonal tuvieron una producción tumoral de la proteína significativamente más baja, así como unos altos niveles de receptores estrogénicos. Finalmente, aunque la posible significación pronóstica de la expresión tumoral de la GCDFP-15 no ha sido bien establecida en el cáncer de mama, se ha descrito que las pacientes con tumores con elevados niveles de mRNA de la proteína tienen un pronóstico más favorable110.
CONCLUSIONES
Se han desarrollando investigaciones prometedoras sobre la implicación de las aspartil-proteinasas en la fisiopatología tumoral del cáncer de mama. De esas investigaciones se desprende una posible implicación de esas enzimas en diferentes mecanismos hormonales asociados al desarrollo tumoral. La evaluación de su expresión tumoral también puede ser de utilidad clínica, ya que pueden tener valor pronóstico para predecir el curso brusco de la enfermedad. Por último, también existen datos que sugieren que su cuantificación en las secreciones mamarias podrían aportar información sobre los estados precursores del carcinoma mamario.
