Se incluyeron pacientes mayores de edad, sin antecedentes de enfermedad cardiovascular (IC, enfermedad arterial coronaria e ictus) a los que se indicó la realización de una TAC multidetector con el objetivo de cuantificar el calcio coronario en el Hospital Universitario Río Hortega de Valladolid por existencia de un cuadro clínico de dolor torácico sin claro perfil isquémico, sin pruebas funcionales definitivas y con baja probabilidad pre-test? de enfermedad coronaria. Se excluyeron los pacientes con deterioro de la función renal o hepática, cáncer, enfermedades inflamatorias, enfermedad arterial aterotrombótica clínica o subclínica diagnosticada previamente, o tratamiento con antibióticos o probióticos en los dos meses anteriores a su inclusión. A todos los participantes se les recogieron datos antropométricos, bioquímicos y factores de riesgo cardiovascular. La evaluación del riesgo cardiovascular se llevó a cabo mediante la puntuación por la escala de Framingham calibrada para la población española (REGICOR), que evalúa el riesgo de padecer enfermedad coronaria (infarto de miocardio o muerte) en los siguientes 10 años. Los pacientes se clasificaron con riesgo coronario bajo (0-9%), moderado (10-19%) y alto (≥ 20%)15.

Este trabajo se ha realizado cumpliendo los principios fundamentales establecidos en la Declaración de Helsinki, en el Convenio del Consejo de Europa relativo a los derechos humanos y la biomedicina y en la Declaración Universal de la Unesco sobre el genoma humano y los derechos humanos. Todos los sujetos dieron su consentimiento informado y el proyecto fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Clínico San Carlos (C.I. 16/237-E).

A todos los pacientes se les realizó una cuantificación del calcio coronario (CCC) mediante TAC multidetector (128 detectores, Siemens Somaton Drive, Siemens Healthcare GmbH, Erlangen, Alemania). El protocolo de estudio incluyó la adquisición prospectiva basado en electrocardiograma (ECG) (ECG-gating) en un latido y sin administración previa de contraste de todo el volumen cardíaco, con posterior reconstrucción de las imágenes obtenidas (grosor de corte de 3,0mm). El análisis posproceso de las imágenes se realizó con un software específico (SYNGO VIA, Siemens Healthcare GmbH), siendo interpretado por dos observadores independientes. Se calculó el score de calcio de Agatston para cada lesión, basado en el área y la densidad de las lesiones calcificadas según método descrito16 y se sumó el total para determinar su valor para cada paciente.

De cada individuo se obtuvo una muestra de heces que se recogió en un tubo con un estabilizante del ADN (OMNIgene-GUT, DNAgenotek, Ottawa, Canadá) y que se almacenó a -80°C hasta su posterior procesado. El ADN microbiano de las muestras se extrajo usando el mini kit QIAamp Fast DNA Stool (Quiagen, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo del fabricante. La integridad del ADN se evaluó con un BioAnalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, CA, EE. UU.), y su concentración se determinó con un fluorómetro Qubit 3.0 utilizando el ensayo dsDNA HS (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, Ca, EE. UU.).

Para cada muestra de heces, se amplificó el gen del ARN ribosomal 16S mediante PCR usando el kit Ion 16S Metagenomics (Thermo Fisher Scientific) que amplifica 7 regiones hipervariables (V2, V3, V4, V6-7, V8 y V9) de dicho gen. Las librerías se prepararon a partir de 5 ng de ADN por muestra, convirtiendo a romos los extremos de los amplicones mediante el kit Ion Plus Fragment Library (Thermo Fisher Scientific) y uniendo identificadores moleculares de ADN con el kit Ion Express Barcode Adapters (Thermo Fisher Scientific). A continuación, las librerías se diluyeron a 22 pM, se sometieron a amplificación clonal por PCR en emulsión con el Ion OneTouch™ 2 System (Thermo Fisher Scientific), y se secuenciaron en un equipo Ion S5™ System utilizando un Ion 520™ Chip (Thermo Fisher Scientific).

Las secuencias obtenidas fueron preprocesadas de manera automática por el software Torrent Suite™ (v5.10.0; Thermo Fisher Scientific). Se eliminaron las regiones de los primers, y las secuencias fueron recortadas a 150 pares de bases usando Python. Los archivos FASTQ se analizaron usando el software QIIME 2 (v2020.2) para derreplicar las lecturas y eliminar las secuencias con una única aparición (singletons). Las secuencias finales se agruparon en unidades taxonómicas operativas (OTU) con un 99% de similitud usando la base de datos SILVA (v138). La asignación taxonómica de las OTU identificadas se realizó utilizando QIIME 2 y la taxonomía de SILVA. La riqueza de especies bacterianas (diversidad alfa) se midió a partir de un perfil de OTU rarificado a una profundidad de secuenciación de 115.435 lecturas. La abundancia relativa de los taxones se calculó como porcentaje basado en el número total de lecturas por muestra. Para estudiar la diversidad beta, se calculó el índice de Bray-Curtis. Se aplicó el análisis de coordenadas principales (PCoA) a la matriz de disimilitud resultante y se utilizaron gráficos de PCoA bidimensionales para la visualización de la estructura composicional entre grupos y muestras. El paquete de software PICURSt2 (v2.2.0-b) se usó para predecir el contenido funcional de las comunidades microbianas como perfil de ortólogos de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kyoto (KEGG). El tamaño del efecto del análisis discriminante lineal (LEfSe) se utilizó para identificar los taxones y las vías funcionales diferencialmente abundantes entre los grupos utilizando los scripts compartidos por el autor (github.com/SegataLab/lefse). Para este análisis se eliminaron los taxones con una abundancia relativa <0,01% y se seleccionaron los resultados con una puntuación logarítmica de LDA (LDA score) ≥2.0 y P <0,05. El protocolo de análisis ha sido publicado previamente más en detalle por nuestro grupo14.

De cada paciente se obtuvo una muestra de sangre periférica por venopunción en tubos de vacío con EDTA como anticoagulante. El plasma se obtuvo centrifugando la sangre a 1.500rpm durante 10 min. Las muestras fueron entonces divididas en alícuotas y almacenadas a -80°C.

Los niveles circulantes de TNF-α e IL-1β se determinaron en el plasma mediante ELISA automatizados (Protein Simple Plex Assay, Biotechne, MN, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. La sensibilidad del ensayo para el TNF-α fue 0,278 pg/ml. Los coeficientes de variación intra- e interensayo fueron 5,0% y 0,771%, respectivamente. La sensibilidad del ensayo para la IL-1β fue 0,064 pg/ml. Los coeficientes de variación intra- e interensayo fueron 4,9% y 0,342%, respectivamente.

La detección de N-óxido de trimetilamina (TMAO) se realizó en muestras de plasma mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas (LC-MS) utilizando como sistema de ionización un electrospray (ESI) y como analizador un cuadrupolo simple (Qp). Las muestras de plasma se desproteinizaron utilizando metanol como reactivo precipitante y se centrifugaron a 12.500rpm durante 2 min a temperatura ambiente. A continuación, se realizó la separación cromatográfica inyectando 10μL del sobrenadante en un sistema LC-MS 2020 (Shimazdu Europa GmbH, Duisburg, Alemania) provisto de una columna de fase reversa C18 (150mm x 4,6mm x 5μm) de Supelco (Merck Life Science SLU, Madrid, España) a 35°C. La elución se llevó a cabo en gradiente con una solución acuosa de ácido fórmico 1N/metanol durante 14 min a un flujo de 0,2mL/min. La detección del TMAO se hizo con un cuadrupolo simple utilizando nitrógeno como gas de nebulización (flujo 1,5 L/min) y gas se secado (flujo 10 L/min) producido por un generador (Peak Scientific Spain SL, Madrid, España). Para llevar a cabo la cuantificación se utilizó la relación de alturas entre el TMAO y el estándar interno, monitorizando los iones moleculares (TMAO: m/Z=76 y D9-TMAO: m/Z=85) en modo Selected Ion Monitoring. Para evaluar los parámetros de linealidad, exactitud y recuperación se prepararon 6 concentraciones de TMAO (Sigma-Aldrich Química S.A., Madrid, España) por duplicado de 1, 5, 10, 25, 50 y 100μmoles/l. La linealidad del método se analizó mediante regresión lineal.

Las variables recogidas en el estudio, así como la diversidad alfa y la abundancia de los diferentes taxones se expresaron como media±error estándar de la media o mediana (rango intercuartílico). La prueba de Shapiro-Wilk se usó para contrastar la normalidad de cada variable. Aquellas que tenían una distribución normal se compararon estadísticamente utilizando la prueba t de Student y las que siguieron una distribución no normal se compararon utilizando la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney. Las variables cualitativas se analizaron con la prueba exacta de Fisher. Las diferencias entre grupos respecto a la estructura de las comunidades bacterianas (diversidad beta) se analizó con un análisis de permutaciones y múltiple ANOVA (PERMANOVA) con 999 permutaciones. La asociación entre las abundancias relativas de los géneros y los niveles plasmáticos de TNF-α e IL-β se analizó mediante correlaciones de Spearman. El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el paquete SciPy de Python. Para todos los análisis, las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si P <0,05.

En este estudio piloto hemos incluido un total de 20 sujetos a los que se les realizó una TAC multidetector por indicación de su médico para descartar la presencia de cardiopatía isquémica. La media de edad fue de 63,5 años y un 60% eran mujeres. Según la ecuación de REGICOR, 15 pacientes tenían un riesgo bajo de sufrir un episodio cardiovascular y dos, un riesgo moderado, con un riesgo medio de 5,0%. De tres pacientes no se pudo calcular su riesgo cardiovascular por tener más de 74 años. Sin embargo, 10 pacientes presentaron una CCC>100, con alta probabilidad de enfermedad coronaria y riesgo cardiovascular alto, frente a otros 10 pacientes que presentaron una CCC≤100, con probabilidad mínima o leve de estenosis coronaria y riesgo cardiovascular de bajo a moderado. Los pacientes con CCC>100 eran significativamente mayores, con una ligera tendencia a mayor presencia de hipertensos y dislipémicos que los pacientes con CCC ≤100, aunque no hubo diferencias significativas en el riesgo cardiovascular evaluado según la ecuación de REGICOR entre ambos grupos (4,5 [3,8-8,8] vs. 4,0 [3,0-6,5], P=NS). Las características antropométricas, clínicas y bioquímicas de los sujetos incluidos, en función de su CCC, están reflejadas en la tabla 1.

La secuenciación de las muestras identificó un total de 4.457.899 lecturas que se clasificaron en 21.092 OTUs. La media de lecturas en las muestras de los pacientes con CCC ≤100 fue de 225.515 y de 220.275 en los pacientes con CCC>100.

Para analizar la composición de la microbiota intestinal, en primer lugar calculamos la diversidad alfa de las muestras, un parámetro que tiene en cuenta la biodiversidad intrínseca de cada muestra. No encontramos diferencias estadísticamente significativas ni en la riqueza bacteriana (expresada mediante curvas de rarefacción) (figura suplementaria 1A del anexo disponible online) ni en el índice de Shannon (un parámetro que tiene en cuenta tanto la riqueza como la distribución de las OTU) (figura suplementaria 1B) en las muestras de los pacientes con CCC ≤100 con respecto a las de los pacientes con CCC>100. El análisis de la diversidad beta de las muestras de microbiota intestinal demostró que las muestras tendían a agruparse en dos grupos en función con su cuantificación de calcio, aunque no alcanzó significación estadística (figura suplementaria 1C).

La asignación taxonómica de las OTU dio lugar a la identificación de 18 filos, 27 clases, 52 órdenes, 115 familias y 408 géneros teniendo en cuenta todos los pacientes incluidos en el estudio. La composición bacteriana de los pacientes con CCC ≤100 fue similar a la que presentaron los pacientes con CCC>100, aunque se observaron diferencias en la distribución de los taxones. En ambos grupos, los filos más abundantes fueron Firmicutes, Bacteroidota (antes Bacteroidetes) y Proteobacteria, correspondiendo a más del 97% de las bacterias identificadas, aunque las abundancias fueron diferentes entre los grupos; en los pacientes con CCC>100, la presencia de bacterias de los filos Bacteroidota y Proteobacteria fue mayor, y la de Firmicutes menor, que en los pacientes sin calcio coronario (fig. 1). Por otra parte, en ambos grupos, alrededor del 3% de las bacterias pertenecían a filos minoritarios, aunque no se identificaron diferencias significativas entre los grupos (fig. 1).

Figura 1.

Composición taxonómica de la microbiota intestinal a nivel de filo (A y B) y abundancia relativa de bacterias pertenecientes a las familias del filo Proteobacteria (C-H). Los resultados se muestran en diagramas de caja con la mediana, el rango intercuartílico y los valores máximos y mínimos.

f: familia; p: filo.

*P<0,05 vs. pacientes con CCC ≤100.

**P<0,01 vs. pacientes con CCC ≤100.

(0.4MB).

Puesto que existía una diferencia de edad significativa entre ambos grupos de pacientes, analizamos la abundancia de proteobacterias en función de la edad de los pacientes (mayores o menores de 74 años). En el grupo de pacientes menores de 74 años, aquellos con CCC>100 seguían mostrando una mayor abundancia de proteobacterias que los pacientes con CCC ≤100 (figura suplementaria 2). En el grupo de pacientes mayores de 73 años, todos los pacientes presentaron un CCC>100, aunque no se observaron diferencias significativas en la cantidad de proteobacterias con respecto a los pacientes menores de 74 años (figura suplementaria 2).

Consecuentemente con el aumento de proteobacterias, se observó una mayor abundancia de bacterias de la clase Gammaproteobacteria (Filo Proteobacteria) (CCC ≤100: 3,8% [2,8-7,0]; CCC>100: 13,5% [7,4-14,4], P <0,05). A nivel de familias, las bacterias de las familias Enterobacteriaceae, Pasteurellaceae,Erwiniaceae, Vibrionaceae y Morganellaceae (Clase Gammaproteobacteria), Micrococcaceae y Corynebacteriaceae (Clase Actinobacteriota -antes Actinobacteria) eran significativamente más abundantes en los pacientes con CCC>100 que en los que tenían un CCC ≤100 (fig. 1C-F). Por el contrario, las familias Coriobacteriaceae (Clase Actinobacteriota) y Marinifilaceae (Clase Bacteroidota) estaban significativamente disminuidas en los pacientes con CCC>100 (fig. 1G-H).

A continuación, realizamos un análisis LEfSe de todos los niveles taxonómicos, una herramienta bioinformática que nos permite inferir si algún taxón podría actuar como biomarcador de los pacientes con riesgo cardiovascular alto según su CCC. El filo Proteobacteria, su clase Gammaproteobacteria y las familias de esta clase Enterobacteriaceae, Pasteurellaceae, Erwiniaceae y Vibrionaceae se identificaron como biomarcadores taxonómicos (LDA score ≥ 2,0 y P <0,05) entre los pacientes con y sin calcio coronario (fig. 2A-C). A nivel de género, la identificación de biomarcadores taxonómicos demostró quince géneros significativamente aumentados en los pacientes con CCC>100 (LDA score ≥ 2,0 y P <0,05), de los cuales diez pertenecían al filo Proteobacteria: Escherichia/Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Salmonella (familia Enterobacteriaceae), Haemophilus, Actinobacillus, Aggregatibacter (familia Pasteurellaceae), Pantoea (familia Erwiniaceae) y Vibrio (familia Vibrionaceae) (fig. 2D).

Figura 2.

Análisis LEfSe mostrando los filos (A), clases (B), familias (C) y géneros (D) identificados como biomarcadores en pacientes con CCC>100 respecto a pacientes con CCC ≤100. La longitud de las barras horizontales representa el LDA score. P <0,05; LDA score ≥2.0. c: clase; f: familia; g: género; p: filo.

(0.36MB).

Los pacientes con CCC>100 presentaron mayores niveles plasmáticos de TNF-α que los pacientes con CCC ≤100 (6,3±0,53 vs. 4,5±0,19 pg/ml, P<0,05). Todos los géneros pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae que se identificaron como biomarcadores de los pacientes con CCC>100 se correlacionaron positivamente con los niveles de TNF-α (tabla 2). Aunque no encontramos diferencias significativas entre los niveles plasmáticos de IL-1β entre ambos grupos de pacientes (0,074±0,034 vs. 0,066±0,023 pg/ml, P=NS), la abundancia de dos géneros bacterianos (Escherichia/Shigella y Salmonella) también se asoció con mayor concentración de IL-1β (tabla 2).

Puesto que los pacientes con CCC>100 se caracterizaron por un aumento de géneros bacterianos productores de TMA como Enterobacter, Escherichia/Shigella y Klebsiella, a continuación, cuantificamos la producción de TMAO, un metabolito bacteriano originado a partir de TMA que se considera un factor de riesgo cardiovascular11. Como se observa en la figura 3, los niveles plasmáticos de TMAO estaban elevados en sujetos con CCC>100 y se correlacionaron positivamente con la cantidad de calcio (R=0,54; P=0,017).

Figura 3.

Niveles plasmáticos de TMAO (A) y abundancia relativa de géneros bacterianos productores de TMA (B) en función de la presencia de calcio coronario. Los resultados se muestran en diagramas de caja con la mediana, el rango intercuartílico y los valores máximos y mínimos. *P<0,05 vs. pacientes con CCC ≤100.

(0.07MB).

Para identificar el perfil funcional de la microbiota intestinal de los pacientes con y sin calcio coronario, realizamos un análisis LEfSe para comparar las rutas metabólicas KEGG de los pacientes con CCC>100 con respecto a los que presentaban CCC ≤100. En los pacientes con CCC>100, identificamos 12 rutas incrementadas con respecto a los pacientes sin calcio, principalmente relacionadas con la síntesis de lipopolisacárido (LPS), mecanismos antioxidantes como el metabolismo del glutatión, síntesis de ubiquinona, o asociadas a infecciones bacterianas o invasión del epitelio por microorganismos (fig. 4).

Figura 4.

Análisis LEfSe mostrando las rutas metabólicas KEGG predichas de los datos metagenómicos en nivel 2 en pacientes con CCC>100 respecto a pacientes con CCC ≤100. La longitud de las barras horizontales representa el LDA score. P <0,05; LDA score ≥2.0.

(0.23MB).