La integridad espermática es esencial para asegurar la competencia reproductiva. Varios estudios han demostrado que los espermatozoides eyaculados presentan cambios asociados con la apoptosis, en particular EPS, disminución de la integridad PMM y fragmentación del ADN.
Las células activadas magnéticamente con microesferas de anexina v reconocen los residuos de fosfatidilserina externalizados en la superficie de los espermatozoides apoptóticos. Además, el uso de microesferas de anexina v para seleccionar espermatozoides no apoptóticos reduce el porcentaje de células alteradas con fragmentación de ADN y aneuploidía, mejorando la posibilidad de embarazo después de los tratamientos de reproducción asistida.
En esta revisión nuestro objetivo es evaluar el posible valor de la selección por células activadas magnéticamente en pacientes infértiles sometidos a tratamientos de reproducción asistida.
The sperm integrity is essential to ensure reproductive competence. Several studies have shown that ejaculated sperm exhibit changes associated with apoptosis, in particular externalisation of phosphatidylserine, decreased MMP integrity, and DNA fragmentation.
The classification of magnetically activated cells with Annexin V microspheres recognises phosphatidylserine residues externalised on the surface of apoptotic spermatozoa. In addition, the use of Annexin V microspheres to select non-apoptotic spermatozoa reduces the percentage of altered cells with DNA fragmentation and aneuploidy, improving the possibility of pregnancy after assisted reproduction techniques.
In this review, our objective is to evaluate the possible value of activated cell magnetic classification technology in infertile patients undergoing assisted reproduction techniques.
Aunque en las últimas décadas los tratamientos de reproducción asistida han ido incrementando su efectividad en términos de tasa de gestación y tasa de recién nacido vivo, aún hay un número significativo de parejas que siguen sin conseguir el embarazo. Al contrario de lo que ocurre con los ovocitos, que pueden obtenerse en número limitado tras un tratamiento de estimulación ovárica controlada, una muestra de eyaculado puede llegar a contener hasta cientos de millones de espermatozoides por mililitro (ml), y cada uno de ellos puede presentar características moleculares diferentes como resultado de los procesos de recombinación meiótica durante la espermatogénesis (Garcia-Herrero et al., 2011).
Se estima que la infertilidad masculina, directa o indirectamente, es la responsable aproximadamente del 50% de los casos de parejas en edad reproductiva con problemas relacionados con la fertilidad (Schlegel 2009), por lo que queda clara la necesidad de analizar las características seminales como parte fundamental en el estudio de la pareja infértil. De forma rutinaria, y como punto de partida, se examina el volumen del eyaculado, la concentración, la motilidad y la morfología espermática según los parámetros establecidos por la Organización Mundial de la Salud (OMS), (World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research 2010); sin embargo se ha podido determinar que entre un 10% y un 15% de los hombres que presentan parámetros dentro de estos rangos de normalidad son infértiles. Por tanto, el seminograma, una prueba básica utilizada para la orientación diagnóstica y terapéutica de la pareja, no es suficiente para predecir el potencial fecundante del espermatozoide, la capacidad de dar lugar a un embrión sano, un embarazo evolutivo y tampoco tiene la capacidad de suministrar información acerca de otras posibles causas de la infertilidad, que incluye tanto defectos en la membrana del espermatozoide (Rajeev y Reddy 2004), como alteraciones genéticas/moleculares (Nakamura et al., 2001, Ferlin et al., 2007), defectos en la cromatina (Erenpreiss et al., 2006), o el efecto de los factores ambientales (Sinawat, 2000), todas con un impacto negativo en los tratamientos de reproducción asistida (TRA) (Seli et al., 2004).
Es por esta razón que en la rutina clínica, y con el objetivo de realizar un análisis más exhaustivo de la calidad espermática, se han introducido otras pruebas, como la tinción vital, la prueba hipoosmótica, las pruebas de especies reactivas de oxígeno (o reactive oxygen species) y la prueba de fragmentación del ADN espermático. En particular, la evaluación del daño del ADN en los espermatozoides y su impacto en los resultados reproductivos ha recibido especial atención, ya que una cantidad creciente de datos demuestran que los altos niveles de fragmentación del ADN están correlacionados con menores tasas de fecundación, de implantación y un aumento de la incidencia de aborto (Giwercman et al., 2010, Zini y Sigman 2009, Larson et al., 2000).
El daño en la estructura de la cromatina espermática puede ocurrir en cualquier etapa de la espermatogénesis y puede ser inducido por factores internos como la apoptosis, la rotura de ADN no reparada durante la remodelación de la cromatina en la espermiogénesis, los radicales libres de oxígeno durante el transporte de los espermatozoides a través de los túbulos seminíferos y el epidídimo, las caspasas endógenas y endonucleasas e, incluso, por factores externos como tóxicos ambientales, quimioterapia, radioterapia (Sakkas y Alvarez 2010), condiciones y tiempo de almacenamiento o técnicas de capacitación espermática (Lo et al., 2002, Jackson et al., 2010).
Por otra parte, se ha planteado la hipótesis de que los espermatozoides aneuploides pueden también conducir a la fragmentación del ADN bloqueando el desarrollo espermático, y producir de esta manera espermatozoides anómalos (Muriel et al., 2007). Aunque algunos autores apoyan este planteamiento al evidenciar una correlación positiva entre la presencia de aneuploidías y fragmentación espermática (Enciso et al., 2013), existen otros que no han encontrado dicha correlación (Balasuriya et al., 2011, Bronet et al., 2012). Además, y aunque se ha reportado que las aneuploidías de origen materno son las principales causas de los abortos espontáneos después de un tratamiento de reproducción asistida, se ha podido establecer que entre el 5-10% de las aneuploidías autosómicas y entre el 50-80% de las aneuploidías cromosómicas sexuales tienen origen paterno (Hassold et al., 2007, Nicolaidis y Petersen 1998).
Así pues se ha intentado analizar la integridad del ADN previo a un tratamiento de infertilidad, pero los métodos utilizados para detectar roturas o el nivel de protaminación o compactación de la cromatina tienen la particularidad de generar la destrucción del espermatozoide (Tavalaee et al., 2009), lo que imposibilita su posterior uso en estos tratamientos.
Apoptosis espermática e infertilidad masculinaLa apoptosis es el conjunto de alteraciones celulares morfológicas y bioquímicas que conducen a la muerte celular, y puede originarse como respuesta a estímulos específicos, como es la exposición a radiación ionizante y agentes quimioterapéuticos, o ser inducida como consecuencia de una lesión o estrés celular. De llevarse a cabo de manera no regulada favorece la presencia de espermatozoides anormales en el eyaculado (Barroso et al., 2000, Sakkas et al., 2002, Sakkas et al., 1999a).
Las características principales de una célula apoptótica son la activación de las caspasas, un punto de no retorno en la muerte celular que determina la fragmentación del ADN, la reducción el potencial de membrana mitocondrial (PMM) y la externalización de la fosfatidilserina (EPS) como resultado de la pérdida de la integridad de la membrana celular (Evenson et al., 2002, Tarozzi et al., 2007), proceso que finalmente permite el reconocimiento por los fagocitos para su eliminación.
Estudios realizados tanto en ratones (Rockett et al., 2001) como en humanos (Sakkas et al., 1999a) demuestran que la apoptosis desempeña un papel importante en la infertilidad masculina y contribuye muy probablemente al fracaso de las TRA, ya que existe la probabilidad de que algunos espermatozoides seleccionados para ser microinyectados presenten características apoptóticas, a pesar de su apariencia normal, lo que puede ser parcialmente responsable de las bajas tasas de fecundación e implantación y el aborto espontáneo tras estos tratamientos (Borini et al., 2006).
Activación de las caspasasLas caspasas son un conjunto de proteínas pertenecientes al grupo de las cisteín-proteasas que participan en la cascada de señalización celular desencadenada en respuesta a señales proapoptóticas. Desde el punto de vista funcional las caspasas pueden actuar como iniciadoras (caspasas 8, 9 y 10) o como efectoras (caspasas 3, 6 y 7) (Bratton et al., 2000, Earnshaw et al., 1999).
La activación de las caspasas es un factor relevante en la muerte celular programada al inducir la lisis de proteínas celulares estructurales y, en un estadio más avanzado, roturas en la cadena de ADN con fragmentación de la misma (Enari et al., 1998). En concreto, la acción de la caspasa-3 (CP-3) induce la activación del complejo «desoxirribonucleasa activado por caspasas» (también llamada CAD), responsable de la degradación de la cromatina (Paasch et al., 2003). Su activación también se ha relacionado con la motilidad espermática en varones infértiles (Wang et al., 2003, Almeida et al., 2005) y la morfología espermática al observar un número significativamente mayor de espermatozoides con residuos citoplasmáticos y externalización de la fosfatidilserina (Paasch et al., 2001).
Reducción del potencial de membrana mitocondrialLas mitocondrias son unos orgánulos que participan en diversas funciones celulares, y característicamente presentan su propio genoma circular, ADN mitocondrial y ribosomas específicos que permiten la síntesis de proteínas locales (St John et al., 2010). Su adecuada actividad en los espermatozoides es necesaria para soportar varios procesos, incluyendo la capacitación (Ferramosca y Zara, 2014), la producción de ATP (Du Plessis et al., 2015), la biosíntesis de hormonas esteroides, la generación de niveles fisiológicos de oxígeno reactivo, la regulación del Ca+2 intracelular y fenómenos similares a la apoptosis (Amaral et al., 2013). Tienen la particularidad de que son especialmente sensibles a fenómenos proapoptóticos debido a su ubicación y compartimentación en la pieza intermedia (Grunewald et al., 2005).
Aunque las mitocondrias paternas se degradan dentro del cigoto, la funcionalidad mitocondrial (membrana y PMM) es de gran importancia para una fecundación exitosa. De hecho, cambios en la integridad/funcionalidad mitocondrial como defectos en la ultraestructura o en su genoma, así como bajo potencial de membrana o consumo alterado de oxígeno, se han correlacionado con la pérdida de la función espermática (particularmente con disminución de la motilidad) (Evenson et al., 1982, Flesch y Gadella, 2000). Es por esta razón que su alteración es considerada un marcador clave de la cascada de apoptosis (Barroso et al., 2006) y presenta además una correlación positiva con niveles de fragmentación de ADN espermático en humanos (Troiano et al., 1998).
Externalización de la fosfatidilserinaEl fosfolípido fosfatidilserina (PS) es una molécula localizada en la cara citosólica de la membrana plasmática que, durante el proceso de apoptosis celular, migra hacia la superficie actuando in vivo como marcador para la destrucción por parte de los fagocitos, constituyéndose así como uno de los primeros fenómenos que se producen durante la apoptosis celular (Vermes et al., 1995). Algunos autores han propuesto que la apoptosis en los espermatozoides eyaculados es el resultado de un fallo espermatogénico (Sakkas et al., 2002, Sakkas et al., 1999a) y por tanto un proceso apoptótico abortivo que ha iniciado antes de la eyaculación (Cayli et al., 2004).
Otros autores, sin embargo, han hallado que los espermatozoides maduros eyaculados pueden externalizar la PS en otros procesos celulares, como la modificación de la membrana plasmática debido a la capacitación y/o reacción acrosómica (De Vries et al., 2003, Gadella y Harrison 2002, Martin et al., 2005) y también en procesos inflamatorios (Aitken et al., 1992, Lessig et al., 2007) o como resultado de su exposición a bacterias (Villegas et al., 2005).
Selección espermática en técnicas de reproducción asistidaEn la actualidad varias técnicas de preparación de espermatozoides son utilizadas como componentes principales de los procedimientos en los TRA. El principal objetivo para emplear estas técnicas es generar la capacitación espermática, que es el conjunto de modificaciones moleculares y fisiológicas que experimentan los espermatozoides de forma natural en las proximidades del ovocito, y que les confieren su capacidad fecundante, y así obtener un número suficiente de espermatozoides móviles viables capaces de fecundar el ovocito.
Las técnicas estándares actuales de preparación de espermatozoides dependen de un enfoque de sedimentación (gradientes de densidad) o migración (swim-up) para separarlos basándose en su motilidad (Salicioni et al., 2007) y son altamente efectivas en la reducción de la fragmentación espermática previo al ICSI (Rawe et al., 2010), pero son incapaces de detectar características ultraestructurales relacionadas con la apoptosis o la integridad del ADN (Cayli et al., 2004, Said et al., 2008, Henkel, 2012). De hecho, se ha podido establecer que cerca del 30% de los espermatozoides, después de someterse a los gradientes de densidad, se encuentran en estado apoptótico tardío o necrótico (De Vantery Arrighi et al., 2009), lo que puede afectar negativamente a los resultados finales.
Así pues, y con el objetivo de seleccionar los espermatozoides más competentes, en los últimos años se han introducido diferentes estrategias que van desde el uso de antioxidantes previo a un ciclo de microinyección espermática (ICSI) (Greco et al., 2005), la utilización de espermatozoides obtenidos a nivel testicular (Ramos et al., 2004) o la identificación de las causas del daño del ADN espermático que permitan reducir el número de espermatozoides apoptóticos. Con el mismo objetivo se ha intentado complementar con otras técnicas que, además de brindar información adicional, no impliquen la destrucción celular. Entre ellas encontramos la selección morfológica de los espermatozoides, que se basa en la evaluación microscópica de la morfología espermática y ha mostrado su eficacia en casos de fallo de implantación (Boitrelle et al., 2014); el aislamiento de espermatozoides maduros mediante la prueba de unión al ácido hialurónico, aunque hasta la fecha presenta un valor clínico limitado y no ha presentado una fuerte correlación con el desarrollo embrionario (Nijs et al., 2010, Sakkas et al., 2004) o la selección de espermatozoides mediante separación magnética (MACS) que aísla aquellos que expresan marcadores de apoptosis celular, como es la externalización del fosfolípido fosfatidilserina.
Separación magnética de células activadas en técnicas de reproducción asistidaLa calidad tanto a nivel genético como bioquímico es altamente relevante a la hora de evaluar la competencia espermática. Aunque algunos autores sugieren que el espermatozoide con alteración en su ADN es capaz de fecundar, y que sus consecuencias no se hacen evidentes hasta que el embrión se ha dividido (Sakkas et al., 2004, Bungum et al., 2007, Gandini, Lombardo et al., 2004), ya se ha comentado que son muchas las alteraciones que pueden condicionar la viabilidad espermática y pueden condicionar en gran medida el éxito de estos tratamientos, no solo en cuanto a tasas de fecundación se refiere, sino también en lo referente al desarrollo embrionario y la obtención de la gestación.
Las alteraciones más notables, cuya extensión está íntimamente relacionada con la función espermática y la fertilidad masculina, son las que afectan a la integridad del ADN (Sakkas et al., 1999b), a sus niveles de fragmentación, a la presencia de grandes cantidades de especies del oxígeno reactivas y apoptosis espermática, así como la expresión de los marcadores propios de la muerte celular programada (Seli et al., 2004, Barroso et al., 2006, Henkel et al., 2004, Host et al., 2000b, Delbes et al., 2013, Host et al., 2000a).
Por tanto, las actuales tasas subóptimas de éxito en TRA pueden atribuirse, al menos en parte, a la inclusión de espermatozoides con características no completamente adecuadas y romper las barreras de selección in vivo en la selección espermática. Esta hipótesis ha generado la motivación para desarrollar nuevos protocolos de selección espermática basados en la presencia de marcadores y manifestaciones de apoptosis, es decir, que incluyan características moleculares, además de las propiedades físicas.
Una de las técnicas introducidas en la práctica clínica se centra en la PS, la cual presenta alta afinidad por la anexina v, una proteína de unión a fosfolípidos que es incapaz de atravesar la membrana plasmática intacta del espermatozoide (Van Heerde et al., 1995). Por lo tanto su unión a la PS en la superficie espermática nos indica que la integridad de la membrana plasmática se encuentra comprometida tal y como se ha descrito con anterioridad y, como consecuencia de todo ello, puede estar reducida su capacidad fecundante (Glander y Schaller 1999, Deng y Lin 2012).
La aplicación de las MACS ha mostrado ser efectiva, incrementando las tasas de gestación al optimizar el procesamiento de la muestra espermática en parejas con infertilidad inexplicada (Makker et al., 2008, Gil et al., 2013, Lee et al., 2010).
Otros autores han evidenciado una reducción en la presencia de marcadores apoptóticos, fragmentación de ADN e incluso aneuploidías en espermatozoides de pacientes normozoospérmicos, como lo demuestra un estudio realizado en 6 muestras seminales analizadas por hibridación in situ fluorescente cuando son comparadas con muestras seminales a las que solo se aplica el tratamiento estándar (Vendrell et al., 2014).
La separación magnética de células activadas también se ha mostrado eficaz en la reducción de la fragmentación del ADN espermático en pacientes con varicocele (Degheidy et al., 2015),y cuando se realiza de forma complementaria a la preparación seminal previo a técnicas de TRA (Bucar et al., 2015, Dirican et al., 2008, Polak de Fried y Denaday 2010, Zhang et al., 2017), de hecho, se ha logrado una disminución hasta del 70% de espermatozoides con EPS, un 60% en aquellos con alteración del PMM y un incremento medio del 50% en la supervivencia espermática (De Vantery Arrighi, Lucas et al., 2009).
En este sentido, y mediante un estudio prospectivo en el que analizaron la normalidad espermática, la fragmentación del ADN, el déficit de protaminas en la cromatina espermática, la externalización de la fosfatidilserina y la actividad de la caspasa-3 en las muestras de 50 varones, los autores concluyen, en primer lugar, que la técnica de gradientes de densidad es más efectiva que MACS al separar espermatozoides con ADN y cromatina íntegra, pero no para aislar espermatozoides con actividad de la caspasa-3 y, en segundo lugar, que el uso combinado de ambos procedimientos (gradiente de densidad y MACS, en este orden) permite obtener mejores índices de calidad espermática (Tavalaee et al., 2012).
Sin embargo, existen resultados que, aunque contradictorios, evalúan las consecuencias que la selección por MACS tiene sobre la motilidad espermática. Mientras algunos autores han detectado una reducción (Degheidy et al., 2015, Nadalini et al., 2014, Cakar et al., 2016) (Lee et al., 2010) otros obtienen una mejoría de la misma cuando se compara con las muestras previas a la aplicación de esta técnica (Said et al., 2005). De igual manera, su utilidad no parece tan clara en los ciclos con donación de ovocitos. El grupo de Romany (Romany et al., 2014) concluye que la selección de espermatozoides que expresan la EPS no mejora los resultados de estos ciclos, y que la potencia metabólica de ovocitos jóvenes puede ser suficiente para reparar el daño del ADN.
Aun así, y teniendo en cuenta estas controversias, parece que hay una evidencia consistente sobre la utilidad de las MACS a nivel molecular, por lo que puede considerarse como complemento a la preparación convencional de la muestra espermática (Delbes et al., 2013) y podría ser una herramienta de utilidad para mejorar la calidad espermática en muestras crioconservadas de pacientes con cáncer, mejorando así el resultado de ICSI (Herrero, Delbes et al., 2013).
ConclusiónDiversos estudios han demostrado que los espermatozoides eyaculados presentan cambios asociados con la apoptosis. En particular la EPS, disminución de la integridad de PMM, fragmentación del ADN y la expresión de una serie de proteínas pro y antiapoptóticas.
Lamentablemente, y aunque en las últimas décadas las técnicas para la preparación seminal y selección espermática previo a las técnicas de reproducción asistida han avanzado, estas no tienen la capacidad de eliminar todos los espermatozoides con características apoptóticas, lo que condiciona el éxito de la fecundación in vitro y ha impulsado la mejora de estos protocolos.
Hasta la fecha, gracias a su fácil implementación y a la evidencia clínica que se está acumulando sobre el uso de la técnica de columnas de anexina v o MACS en los procedimientos de rutina del laboratorio de fecundación in vitro para la selección de espermatozoides no apoptóticos, se puede considerar como la única técnica que, además de complementar los protocolos convencionales de preparación seminal, puede mejorar las tasas de éxito de TRA.
Serían recomendables más estudios para evaluar los riesgos potenciales que puedan derivarse del empleo de las microperlas magnéticas de anexina v y para demostrar si su eficacia se mantiene en los ciclos con ovocitos procedentes de donación.
Responsabilidades éticasProtección de personas y animalesLos autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.
Confidencialidad de los datosLos autores declaran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicación de datos de pacientes.
Derecho a la privacidad y consentimiento informadoLos autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses
